VAMP8 to v-SNARE, który pośredniczy w egzocytozie podstawno-bocznej w mysim modelu alkoholowego zapalenia trzustki ad 6

Gdy WT acinus poddano wstępnej obróbce za pomocą 20 mM EtOH, a następnie stymulowano 3 (3M Cch (Figura 5, Cef), egzocytoza wierzchołkowa była zablokowana, i, co zauważono ostatnio, zaobserwowano egzocytozę na podstawowym PM (Figura 5C) ( 6. 8). Figura 5C pokazuje sekwencję czasową statycznych obrazów akinusa z 5 komórkami (strzałka wskazuje gorący punkt analizowany na Figurze 5D), podczas gdy Figura 5E pokazuje 2 obrazy (wykonane w minucie i 30 minut) w kolorze pseudokolorowym, aby wyraźniej pokazać zwiększone fluorescencja podstawowego punktu krytycznego PM. Dane przedstawione na fig. 5D przedstawiają rytmiczne zmiany do podobnych pików, wskazując cykle pojedynczej egzocytozy ZG i opróżniania zawartości. Wcześniej wykazaliśmy, że te gorące punkty FM1-43 zostały połączone z egzocytowaną amylazą (4). Jako próbki kontrolne sam 20 mg EtOH (1 godz.) Nie wywierał wpływu na egzocytozę, a wstępne traktowanie 1.M Atp blokowało stymulowaną przez Cch apikcję szczytową i wywoływaną EtOH / Cch egzoptozy podstawno-bocznej (dane nie pokazane). Figura 5VAMP8 jest wymagana dla EtOH do przekierowania wywoływanej przez CCH zewnętrznej egzocytozy do gąbkowego podstawowego PM, ale nie jest wymagana w przypadku egzocytozy stymulowanej przez Cch. A, C, F i H są reprezentatywnymi sekwencjami statycznych obrazów epifluorescencyjnych FM1-43, podczas gdy B, D, G i I są ich odpowiednimi fluorescencyjnymi śladami w czasie rzeczywistym dla każdego regionu (światło wierzchołkowe, szczytowy biegun ZG, podstawowy PM [ BPM] lub podstawowe punkty zapalne PM) analizowanego akinu. (A) Wzrost fluorescencji w wierzchołkowym świetle ze względu na stymulację 3. M Cch w WT acini. (C) Pojawienie się gorącego miejsca (HS) na podstawowym PM (oznaczonym strzałkami) na 20 mM EtOH (preinkubacja) plus stymulacja 3. M Cch w WT acini. (E) Dwa obrazy z C w minucie i 30 minut w kolorze pseudokolorowym, aby lepiej zwizualizować zmiany intensywności fluorescencji tego gorącego miejsca przy podstawowym PM (strzałki) wskazujące, że miała miejsce egzocytoza. (F) Wzrost fluorescencji w wierzchołkowym świetle ze względu na stymulację 3. M Cch w Vamp8. /. acini. (H) Nie wystąpiła egzocytoza po 20 mM EtOH (preinkubacja) plus stymulacja 3. M Cch w Vamp8. /. acini. W badaniach tych myszy trzustkowe acini inkubowano wstępnie w 37 ° C z 2 .M FM1-43, aż do uzyskania stabilnej fluorescencji na PM i podanych protokołów stymulacji. Obrazy zostały zrobione z prędkością klatki / s przez 30 minut. Natężenie dla każdego gorącego punktu normalizowano do natężenia PM przylegającego do niego, przy czym względna intensywność podstawowego PM / PM, gdy nie pojawił się gorący punkt, wynosiła 1. Wszystkie przedstawione eksperymenty są przedstawicielami 3 eksperymentów na warunek przeprowadzonych na 4 izolatach acini. (12 eksperymentów na stan). Pełne rozmiary obrazu są następujące: 40. M2 (A), 50. M2 (C, E i H) i 47. M2 (F). W grze Vamp8. /. acini, byliśmy zaskoczeni obserwowaniem egzocytozy wierzchołkowej (figura 5F), chociaż względny obszar i intensywność fluorescencji były mniejsze (21,3%. 1,8%, P <0,05) niż wartości WT acini (Figura 5G). Niemniej jednak wskazywało to, że egzocytoza wierzchołkowa, którą jest fuzja ZG z apikalnym PM per se, nie była zablokowana przez delecję VAMP8. Jednak kolejna sekwencyjna egzocytoza w głębszych warstwach ZG w wierzchołkowym biegunie mogła zostać zredukowana. Przy wstępnym traktowaniu 20 mM EtOH, po którym następowała stymulacja 3. M Cch (Figura 5, H i I), egzocytoza nie była wykrywalna w wierzchołkowym PM, ale w przeciwieństwie do WT acini, egzocytoza nie była obserwowana przy podstawowym PM, co łącznie odpowiadałoby za dalsza redukcja sekrecji amylazy pokazana na Figurze 3. Jak oczekiwano, sam 20 mM EtOH (1 godz.) nie wywierał wpływu na egzocytozę w Vamp8a /. acini i wstępne traktowanie .M Atp zablokowało stymulowaną przez Cch apocytozę wierzchołkową (dane nie pokazane). Podsumowując, wyniki te wskazują, że VAMP8 nie jest wymagany do egzocytozy wierzchołkowej, ale jest wymagany do egzocytozy na podstawowym PM. VAMP8 jest wymagany do egzocytozy na lateralnym PM i do fuzji ZG-ZG. Wcześniej zauważyliśmy, że FM1-43 miał ograniczony dostęp do bocznego PM, nawet w małych acini (4, 6. 8). Ponieważ wcześniej obserwowaliśmy przez mikroskopię elektronową (EM), że obróbka EtOH / Cch wywoływała rozległą egzocytozę na bocznym PM (6), wykorzystaliśmy tę strategię do zbadania, czy VAMP8 odgrywa rolę w bocznej egzocytozie PM (Figura 6). EM umożliwiał również badanie ZG wewnątrz komórki, w tym obfitość ZG i obecność fuzji ZG-ZG (Figura 7). Egzocytoza w przestrzeń śródmiąższową i następna aktywacja zymogenu przyczyniłyby się do indukcji zapalenia trzustki (14, 30), a co za tym idzie obserwowano również zmiany morfologiczne uszkodzenia komórek. Odwrotnie, oczekuje się, że zniesienie bocznej egzocytozy zmniejszy uszkodzenie trzustki. Aby zbadać te możliwości, zbadaliśmy tkanki trzustki za pomocą EM z WT zasilanego ED i CD oraz Vamp8. /. myszy opisane w Tabeli 1 [patrz też: cytologia płynna, kot nie chce jeść, embolizacja naczyniaka ]