Amylazę wydzieloną do pożywki określono i wyrażono jako procent całkowitej amylazy komórkowej w odpowiedniej próbce. Każda wartość jest średnia. SD z trzech próbek na eksperyment z 5 niezależnych doświadczeń (n = 15). * P <0,05 w porównaniu z KRH; # P <0,05 w porównaniu z myszami WT. (D) Wpływ 6-tygodniowego ED na stymulację 3-AM Cch. Stymulowaną amylazą. Tutaj, zdyspergowane acini uzyskano z WT i Vamp8 . / CD karmionych CD lub ED. myszy, a następnie stymulowano 3 .M Cch (1 godz.), .M Atp (1 godz.), a następnie 3 M Cch (1 godz.) lub KRH (kontrola). Amylazę wydzieloną do pożywki określono i wyrażono jako procent całkowitej amylazy komórkowej w odpowiedniej próbce. Każda wartość jest średnia. SD z trzech próbek na eksperyment z 5 niezależnych doświadczeń (n = 15). * P <0,05 w porównaniu z CD; # P <0,05 w porównaniu z myszami WT. Ponieważ wyżej opisane badania (patrz także Figura 3C) były wstępnymi badaniami wstępnymi EtOH, zbadano wpływ przewlekłego leczenia EtOH z 6-tygodniowym ED (22) w porównaniu z CD (Figura 3D), a następnie wyizolowano acini z tych myszy do badań sekrecyjnych. U myszy WT, 3 .M Cch stymulowało mniej uwalniania amylazy ze zdyspergowanych acini z podawaniem ED (11,2% <1,0%) w porównaniu do myszy karmionych CD (17,4%. 1,2%), 35,6% redukcji (P <0,05). W grze Vamp8. /. u myszy zaobserwowano, że pobudzone wydzielanie amylazy jest równomiernie zmniejszone w każdych warunkach w porównaniu z myszami WTT acini. Warto zauważyć, że uwalnianie stymulowane 3. M Cch. Zostało zmniejszone o 65% (P <0,05) w Vamp8. /. acini (6,1%> 0,6%) w porównaniu z WT acini u myszy karmionych CD (17,4% . 1,2%). W grze Vamp8. /. acini, ED powodowało 38% (P <0,05) zmniejszenie stymulowanego wydzielania w porównaniu z acini z karmieniem CD (odpowiednio 3,8%. 0,6% w porównaniu z 6,1%. 0,6%) i 66% (P <0,05) spadek w porównaniu z z WT acini z podawaniem ED (odpowiednio 3,8% . 0,6% w porównaniu z 11,2% . 1,0%). Częściowa blokada przez Atp we wszystkich tych warunkach wskazuje, że resztkowe uwalnianie amylazy było stymulowane specyficznie przez Cch. Mobilizacja wapnia nie ma wpływu na Vamp8. /. acini. Sygnalizacja wapniowa jest głównym wydarzeniem sygnalizacji komórkowej pośredniczącym w wydzielaniu trzustkowym trzustki (28). W związku z tym zbadaliśmy, czy mobilizacja wapnia może być zaburzona w Vamp8. /. acini, co może częściowo tłumaczyć zmniejszenie wydzielania. Wewnątrzkomórkowe stężenia wapnia ([Ca2 +] i) w populacjach komórek acini trzustkowych stymulowanych przez substancje pobudzające zwykle wykazują szybki wzrost do wartości szczytowej, po której następuje nieco niższa utrzymująca się faza plateau (28). Figura 4 pokazuje praktycznie identyczne odpowiedzi (fazy szczytu i plateau [Ca2 +] i) między WT i Vamp8a /. acini stymulowane maksymalnym Cch (80. M). Ten wynik wskazuje, że defekty egzocytotyczne w Vamp8. /. acini (ryc. 3, C i D) można przypisać defektom w maszynie do syntezy membranowej per se, a nie uwolnieniu Ca2 +. Figura 4 Delecja VAMP8 nie zmienia mobilizacji [Ca2 +] i w stymulowanym Cch trzustkowym zapaleniu trzustki. Fari-2. Naładowany trzustkowy acini z WT (czarne ślady) i Vamp8. /. (ślady szare) myszy ponownie zawieszono w roztworze Q zawierającym mM CaCl2, inkubowano przez 5 minut z podłożem, aby uzyskać wartości linii podstawowej, a następnie stymulowano 80 (3 M Cch. Strzałka wskazuje czas, w którym dodano agonistę. [Ca2 +] i jest wyrażany w nM. Jest to reprezentacja 3 niezależnych eksperymentów na różnych preparatach acini. Ponieważ zdarzenia egzocytotyczne w komórce groniastej trzustki występują w kilku miejscach, w tym w wierzchołkowych PM, podstawowym i bocznym PM oraz w miejscach fuzji ZG-ZG, przeprowadziliśmy serię badań w celu dokładnego określenia, które z tych miejsc egzocytozy są zakłócone lub zakonserwowane przez VAMP8. delecja i wstępne traktowanie EtOH. Warto zauważyć, że niedawno zgłosiliśmy, że wstępne leczenie alkoholem lub dieta przewlekła alkoholowa może przekierować submaksymalną wywołaną Cch (lub wywoływaną przez CCK) egzocytozę wierzchołkową do powierzchni boczno-bocznej PM, zakończoną alkoholowym zapaleniem trzustki (6. 8). Dało to kolejną możliwość sprawdzenia, czy VAMP8 odgrywa rolę w eksocytozie podstawno-bocznej, w której pośredniczy EtOH / Cch, jako możliwy mechanizm leżący u podstaw alkoholowego zapalenia trzustki. VAMP8 jest wymagany do podstawowej egzocytozy PM, ale nie do egzocytozy wierzchołkowej. Jak wcześniej podano (4, 6 8 8), użyliśmy lipofilowego barwnika FM1-43, który fluoryzuje po kontakcie z lipidem PM, aby obrazować w czasie rzeczywistym egzocytozę, która występuje przy PM (29). Podobnie jak w naszych poprzednich doniesieniach, submaksymalne Cch (3. M) wywoływało egzocytozę wierzchołkową w WT acini, obserwowaną jako postępujący wzrost wielkości i intensywności fluorescencji w pobliżu wierzchołkowego światła, z pewną penetracją do głębszych warstw ZGs w obrębie szczytowych biegunów (4, 6. 8) (rysunek 5, A i B) [patrz też: tureckie allegro, embolizacja naczyniaka, cytologia płynna ]