Utrata ciąży w zespole antyfosfolipidowym – możliwy mechanizm trombogenny ad

Trzecią pacjentką była 63-letnia kobieta z udarem, zatorowością płucną i zawałami na skórze rąk. Antyfosfolipidowe IgG od pierwszego pacjenta użyto do określenia, czy pierwotne trofoblasty łożyskowe są dotknięte w taki sam sposób jak linia komórek trofoblastów. Wpływ IgG na trofoblast Aneksynę V
Ludzką linię komórek trofoblastów (BeWo) otrzymano z American Type Culture Collection (Rockville, MD) i utrzymywano w sposób opisany w innym miejscu 13,14. Komórki BeWo zawieszono ponownie w podłożu podstawowym złożonym z mieszaniny czerwieni fenolowej 1: 1. -Free Ham s F12 i zmodyfikowanego Eagle a Dulbecco oraz 10 procent płodowo-cielęcej surowicy. Następnie wysiewano je w gęstości 60 000 komórek na dołek w 96-studzienkowych płytkach do hodowli i hodowano do konfluencji (około 130 000 komórek na studzienkę). Dodano antyfosfolipidowe przeciwciało IgG lub kontrolne IgG (2 mg na mililitr) w podłożu podstawowym plus 10 procent surowicy płodowej cielęcej i komórki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4 ° C w celu zahamowania recyklingu błon i pęcherzyków. Komórki następnie przemywano jeden raz w buforze HEPES (pH 7,4) zawierającym 5 mM chlorek wapnia, a następnie przemywano buforem HEPES zawierającym mM eteru bis (.-aminoetylowego glikolu etylenowego) -N, N, N , N – kwas tetraoctowy (EGTA) w miejsce wapnia, aby zdysocjować aneksynę V. powierzchni komórkowej. Poziomy aneksyny V zostały określone przez enzymatyczny test immunosorpcyjny10,15, w którym zastosowano uprzednio scharakteryzowaną, oczyszczoną przez powinowactwo, monospecyficzną, poliklonalną króliczą anty-aneksynę. Przeciwciała V IgG.9 W testach, w których dodawano znane ilości oczyszczonego aneksyny V, obecność antyfosfolipidu lub kontrolnej IgG nie powodowała zmniejszenia poziomów aneksyny V. Wszystkie badania przeprowadzono z czterokrotnymi studzienkami hodowlanymi. Badania wykluczenia błękitem trypanowym wykazały, że traktowane komórki były żywotne co najmniej w 95%.
Eksperymenty z hodowanymi pierwotnymi trofoblastami
Aby ustalić, czy efekty zaobserwowane w linii komórek trofoblastu wystąpiły również w przypadku pierwotnie hodowanych trofoblastów (cytotrofoblastów), uzyskaliśmy tę ostatnią z kobiet poddawanych planowym cesarskim cięciom. Komórki zostały wyizolowane poprzez modyfikację procedury Douglasa i Kinga 16, w których przeciwciała anty-CD45 skoniugowane z mikrosferami magnetycznymi (Advanced Magnetics, Cambridge, Mass.) Zastąpiono przeciwciałami anty-HLA stosowanymi w pierwotnej procedurze. przemyto, ponownie zawieszono w podłożu podstawowym uzupełnionym 2-procentową surowicą cielęcą pozbawioną węgla drzewnego i suplementem do hodowli (ITS +, Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) i wysiano na 96-studzienkowych płytkach do hodowli przy gęstości 100 000 komórek na studzienkę. Hodowle utrzymywano w 37 ° C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5 procent dwutlenku węgla i 95 procent powietrza, a pożywkę zmieniano po 48 godzinach.
Komórki pozostawiono do utworzenia syncji przez 72 godziny przed dodaniem IgG, co przeprowadzono w sposób opisany powyżej dla linii komórek trofoblastów. Końcowe płukanie buforem HEPES zawierającym mM EGTA badano na aneksynę V, jak opisano powyżej. Ponieważ hodowane pierwotne trofoblasty nie ulegają proliferacji, wyniki tych eksperymentów zostały znormalizowane dla stężeń DNA, które zostały określone za pomocą fluorymetrii na komórkach po ich oderwaniu, jak to opisano w innym miejscu.18 Wszystkie te eksperymenty przeprowadzono z czterokrotnie powtórzonymi studzienkami hodowlanymi.
Eksperymenty z hodowanymi komórkami śródbłonka żyły pępkowej
Komórki śródbłonka żyły pępowinowej zebrano i hodowano jak opisano wcześniej.19 Wysiewano je w gęstości 20000 komórek na studzienkę w 96-dołkowych płytkach hodowlanych, pozwalano wzrastać do zlewania (około 140 000 komórek na studzienkę) i traktowano w ten sam sposób. sposób jak trofoblasty BeWo
[patrz też: dekstran, polyporus, bupropion ]
[przypisy: demencja starcza agresja, dieta kopenhaska jadłospis pdf, dieta wrzodowa jadłospis ]