z dawką nasycającą (100 ug, patrz poniżej) przeciwciała anty-DNGR-1 skoniugowanego z Alexa Fluor 488 lub z taką samą ilością podobnie skoniugowanego kontrolnego dopasowanego izotypu. Analiza całkowitej liczby komórek śledziony lub węzłów chłonnych 16 godzin po wstrzyknięciu wykazała specyficzne znakowanie CD8 (3 + DC i pDC, chociaż intensywność sygnału była znacznie większa na dawnym typie DC (CD8a + DC MFI. 350. 400 w porównaniu z pDC MFI <65 <70; Figura 3A i dodatkowa Figura 7). Żadna inna populacja leukocytów nie została wyznakowana tą procedurą, co pokazuje niezwykłą swoistość in vivo anty-DNGR-1 (figura 3A i dodatkowa figura 7). Przeciwnie, anty-DEC-205 wiąże się z wieloma typami komórek, gdy są stosowane w tej samej dawce i, oprócz CD8 (3 + DC, silnie znakuje CD11clo pochodzące z skóry DC i plami komórki CD11c-ujemne (dodatkowa Figura 7). Warto zauważyć, że nawet lokalne podawanie małych ilości znakowanego przeciwciała anty-DNGR-1 do łapek stóp było wystarczające do oznaczenia śledzionowych podzbiorów DC (Figura 3B). Niskie dawki przeciwciała (np. 2 .g) preferencyjnie znakowały CD8 (3 + DC nad pDC, zgodnie z względnymi poziomami ekspresji DNGR-1 w 2 podgrupach i sugerując, że takie niskie poziomy można zastosować do selektywnego nakierowywania na CD8y + DCs in vivo (Figura 3B). Wnioskujemy, że podawanie anty-DNGR-1 można stosować do specyficznego znakowania CD8a + cDC i, w mniejszym stopniu, pDCs in vivo. Figura 3 Specyficzne znakowanie CD8a + DC i pDC in vivo mAb anty-DNGR-1. (A) Myszom wstrzyknięto dożylnie 100 .g skoniugowanego z Alexa Fluor 488 (3 przeciwciała anty-DNGR-1 (7H11) lub dopasowanego pod względem izotypu (szczurzy IgGl), a splenocyty analizowano dzień później. Wykresy punktowe pokazują CD11c w porównaniu z Alexa Fluor 488 w myszach z wstrzykniętym przeciwciałem anty-DNGR-lp (prawy panel) lub szczurzy IgGl (lewy panel). Wykresy konturowe pokazują CD4 kontra CD8. oraz profile Ly6C versus B220 populacji CD11chi i CD11cint DNGR-1 + zakreślone na wykresie punktowym. Liczby reprezentują odsetek zdarzeń we wskazanej bramce. (B) Myszom wstrzyknięto sc ze wskazanymi dawkami skoniugowanego antygenu Alexa Fluor 488a anty-DNGR-1 (7H11) lub pojedynczej dawki dopasowanej izotypowo kontroli (szczurzy IgGl, 20 .g / mysz) i analizowano splenocyty dzień później. Histogramy wykazują wybarwianie CD8a + DC lub pDC uzyskanych przy różnych dawkach anty-DNGR-1 (zielona linia, 0,5 .g, niebieska linia, 2 .g, czerwona linia, 5 .g, gruba czarna linia, 20 .g) lub dopasowany do izotypu (cienka czarna linia). Dolny panel pokazuje MFI z anty-DNGR-1 podzieloną przez otrzymaną z 20 .g kontroli dopasowanej izotypowo dla każdego podzbioru DC lub dla komórek śledziony innych niż DC. DNGR-1 jest receptorem endocytowym. Ponieważ wiele lektyn typu C na komórkach szpikowych służy jako receptory endocytowe (34, 35), testowaliśmy zdolność internalizacji DNGR-1 z powierzchni komórki. BMD Flt3L znakowano w temperaturze 4 ° C biotyną anty-DNGR-1, płukano i inkubowano w 4 ° C lub 37 ° C przez różne okresy czasu przed barwieniem streptawidyną-PE. Barwienie podtypu CD8. + – podobnego do populacji BMDC Flt3L zmniejszono 4-krotnie po 2 godzinach inkubacji w 37 ° C, przy minimalnym spadku komórek inkubowanych w 4 ° C (Figura 4A). Analiza konfokalna komórek wybarwionych koniugatami anty-DNGR-1 Alexa Fluor 488 ujawniła obecność mAb w przedziałach wewnątrzkomórkowych po 2 godzinach inkubacji w 37 ° C (Figura 4B). Podobne dane uzyskano w heterologicznym typie komórek transfekowanym w celu ekspresji DNGR-1 (dane nie pokazane). Zatem DNGR-1 może pośredniczyć w dostarczaniu związanego przeciwciała do szlaku endocytarnego. Figura 4Edocytoza mAb anty-DNGR-1 w BMDC Flt3L. (A) BMDC Flt3L znakowano mAb anty-DNGR-1 7H11 jak wyszczególniono w Methods i inkubowano przez wskazany czas w 4 ° C lub 37 ° C przed dodaniem streptawidyny-PE. Dane reprezentują MFI dla podzbioru CD24hi. Histogramy przedstawiają rzeczywiste profile barwienia: gruba czarna linia, barwienie streptawidyną-PE natychmiast po oznakowaniu biotyną anty-DNGR-1; niebieska linia, po 2 godzinach w 4 ° C; czerwona linia, po 2 godzinach w 37 ° C; cienka czarna linia, kontrola dopasowana izotypowo. (B) BMD Flt3L znakowano koniugowanymi mAb anty-DNHR-1 Alexa Fluor 488a (prawe panele 7H11) lub kontrolą izotypową (szczurzy IgGl, lewe panele) i inkubowano przez 2 godziny w 4 ° C (górne panele) lub 37 ° C (dolne panele) przed analizą konfokalną. Obraz przedstawia pojedynczą sekcję optyczną (<0,7 .m). Zwróć uwagę na punktowe barwienie wewnątrz komórek inkubowanych w 37 ° C, co wskazuje na endocytozę. Oryginalne powiększenie, × 630. Anty-DNGR-1 może dostarczać antygen in vivo do CD8a + DC dla prezentacji krzyżowej MHC klasy I. Aby ocenić, czy zdolność endocytozy DNGR-1 i jej selektywny model ekspresji można wykorzystać jako środek dostarczający antygenu do prezentacji komórkom T, przetestowaliśmy model prezentacji krzyżowej [patrz też: dyslipidemia aterogenna, hipertriglicerydemia, czepota puszysta ]