Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC cd

Wszystkie 3 mAb można zastosować do immunoprecypitacji mDNGR-1 znakowanego HA z transfekowanych komórek (Figura 1A). Pozorna masa cząsteczkowa (MW) DNGR-1 wynosiła około 102 kDa w warunkach nieredukujących i około 51 kDa w warunkach redukujących (Figura 1B). Wskazuje to, że cząsteczka istnieje jako dimer, prawdopodobnie stabilizowany przez wiązanie dwusiarczkowe obejmujące konserwowaną cysteinę w regionie łodygi (Suplementowa Figura 2), jak powszechnie można znaleźć w innych lektynach typu C grupy receptora NK (45). Warto zauważyć, że MW monomeru była znacząco wyższa niż 29,7 kDa przewidywana z sekwencji białka rdzeniowego, co sugeruje, że receptor jest silnie glikozylowany. Zgodnie z tą możliwością, mysie i ludzkie DNGR-1 mają domniemane miejsce N-glikozylacji (Asn81) i przypuszczalne miejsce przyłączenia dla glikozoaminoglikanów (Ser104 u myszy i Ser106 u ludzi), oba w regionie łodygi (Suplementowa Figura 2). Figura 1Biochemiczna charakterystyka mysiego białka DNGR-1. (A) Lizat z komórek Phoenix stabilnie transfekowanych wektorem retrowirusowym kodującym znakowany HA mDNGR-1 był blotowany metodą Western (WB) z anty-HA przed lub po immunoprecypitacji z anty-HA lub wskazanymi przeciwciałami anty. MDNGR-1. (B) Western blot z użyciem mAb anty-DNGR-1 397 do sondowania lizatów komórek Phoenix wyrażających (+) lub nie wyrażających (.) DNGR-1 w warunkach redukujących (prawo) i nieredukujących (lewe). Ekspresja DNGR-1 jest ograniczona do CD8 + DC i pDC. Zbadaliśmy wzór ekspresji mDNGR-1 w tkankach myszy. W śledzionie cząsteczka była wyrażana przez podzbiór CD11c + DC, ale nie przez CD11c. komórki, w tym komórki B, komórki T, komórki NK, komórki NKT, monocyty, makrofagi lub granulocyty (Figura 2A i dane nie przedstawione). W obrębie frakcji DC, DNGR-1 ulegał ekspresji na bardzo wysokich poziomach przez CD8 + cDC, ale nie przez CD4 + lub DN cDC (Figura 2A). Ponadto, receptor był również eksprymowany w pDC, ale na znacznie niższym poziomie niż w CD8 (3 + cDC (mediana intensywności fluorescencji [MFI]> 60 w porównaniu z> 400, kontrola izotypowa MFI <8). Ponadto barwienie CD8 (3 + DC było unimodalne, co wskazuje na jednolitą ekspresję DNGR-1, podczas gdy barwienie pDC było mniej jasne i mogło reprezentować ekspresję przez subpopulację komórek (Figura 2A i dane nie pokazane, patrz poniżej). Wzorzec ekspresji DNGR-1 oceniany przez barwienie przeciwciał w dużej mierze zgadzał się z analizą ekspresji mRNA DNGR-1 w posortowanych podzbiorach DC (dodatkowa Figura 3). Figura 2Mouse ekspresja DNGR-1 jest ograniczona do CD8a + DC i pDC. (A) Ekspresja DNGR-1 w śledzionie myszy. Splenocyty wybarwiono biotynową anty-DNGR-1 7H11 (gruba linia) lub szczurzą biotynową IgG1 (cienka linia, kontrola dopasowana pod względem izotypu), a następnie streptawidynę-PE i przeciwciała przeciwko CDllc, CD4, CD8a i Ly6C. CD11c + i CD11c. komórki (górny rząd) lub różne podzbiory DC (dolne rzędy) zostały określone przez bramkowanie elektroniczne, jak pokazano na wykresach punktowych. Ekspresję DNGR-1 pokazano na odpowiednich histogramach. Liczby wskazują procent zdarzeń w bramce. (B) Ekspresja DNGR-1 w Flt3L-BMDC. Histogramy wykazują barwienie anty-DNGR-1 (gruba linia) w porównaniu z dopasowaną izotypowo kontrolą (cienka linia) w komórkach B220 + odpowiadających pDC, komórkom CD24hiCD11blo odpowiadającym CD8 (3 + DC i komórkom CD24loCD11bhi odpowiadającym CD8. DC po bramkowaniu jak wskazano. Liczby reprezentują odsetek zdarzeń we wskazanej bramce. Podobnie jak w śledzionie, ekspresja DNGR-1 w węzłach chłonnych i grasicy była również ograniczona do CD8 (3 + cDCs i pDC, ale poziomy ekspresji w byłym podzbiorze były zawsze dużo wyższe niż w tym ostatnim (Suplementowa Figura 6 i dane nie pokazane). . Nie wykryto barwienia DC pochodzących z tkanek, takich jak śródmiąższowe DC i (w węzłach chłonnych SC) domniemanych potomków skórnych DC skóry i komórek Langerhansa (dodatkowa Figura 6). Podobnie, DNGR-1 nie ulegał ekspresji w skórze naskórka lub w innych tkankach nielimfoidalnych (dane nie pokazane). Jako model do analizy funkcji DNGR-1 in vitro, analizowaliśmy ekspresję w DC pochodzących od myszy BM (BMDC) generowanych przez hodowlę w GM-CSF lub w Flt3L. DNGR-1 nie był wyrażany przez BMDC GM-CSF (dane nie pokazane), ale był wysoce eksprymowany w CD11bloCD24hiB220. podzestaw BMDC Flt3L (Figura 2B), który odpowiada podzestawowi CD8. + DC (46). DNGR-1 był również wyrażany, na znacznie niższym poziomie, przez podzbiór BMCD CD11bloB220 + Flt3L, które są równoważne z pDC (Figura 2B). Wnioskujemy, że DNGR-1 myszy jest wysoce ekspresjonowany na CD8 (3 + cDC iw mniejszym stopniu na podzbiorze pDC, bez ekspresji na innych typach komórek. Anty-DNGR-1 selektywnie znakuje CD8a + DC i pDC in vivo. W celu określenia, czy populacje CD8 (3 + DC i pDC mogą być wyznakowane przeciwciałem anty-DNGR-1 in vivo, wstrzyknięto myszom iv [więcej w: kot nie chce jeść, dehydratacja krążków międzykręgowych leczenie, allegro pok ]