Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad 11

W przypadku badań znakowania in vivo skoniugowane z Alexa Fluor 488a anty-DNGR-1 lub mAb kontrolne dopasowane pod względem izotypu wstrzyknięto iv we wskazanej dawce, a tkanki przygotowano i analizowano po 16 godzinach. Przeciwciała swoiste dla ludzkiego CD3, CD14, CD19, CD56, HLA-DR, CD34, CD123 i CD16 zakupiono z BD, a CD1b / c i BDCA-3 pochodziły z Abcam. Ludzkie komórki jednojądrzaste zablokowano 100 ug / ml ludzkiej IgG (Sigma-Aldrich) i zabarwiono jak powyżej. Dane pozyskano na FACSCalibur (BD Biosciences) i analizowano za pomocą oprogramowania FlowJo (Tree Star Inc.). Immunoprecypitacja i Western blot. Komórki Phoenix stabilnie eksprymujące DNGR-1 poddano lizie w 50 mM HEPES (pH 7,4), 150 mM chlorku sodu, 100 mM fluorku sodu, 10 mM pirofosforanie tetrasodowym, mM ortowanadanu sodu (pH 10,0), mM EDTA (pH 8,0), 1,5 mM chlorek magnezu, 10% glicerol, 1% Triton X-100, mM PMSF i kompletne tabletki koktailowe inhibitora proteazy (Roche). Nierozpuszczalny materiał odrzucono, a stałą ilość lizatu poddano immunoprecypitacji, stosując .g kulek anty-DNGR-1 lub królika anty-HA (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i GammaBind Plus Sepharose (GE Healthcare). Białka wymywano z kulek w warunkach nieredukujących i rozdzielano przez SDS-PAGE, przenoszono na błonę Immobilon PVDF (Millipore) i sondowano króliczymi przeciwciałami anty-HA lub anty-Clec9a. Alternatywnie, oczyszczone lizaty gotowano w buforze obciążającym żel zawierający SDS pod nieredukującym lub redukującym (10% (3-merkaptoetanolem) warunkach i rozdzielano, przenoszono i sondowano, jak opisano powyżej. Mikroskopia. Mysie komórki BMDC pochodzące z myszy FLt3L lub komórki transfekowane DNGR-lp inkubowano z 10 .g / ml mAb 2,4 G2 w celu zablokowania FcyR, a następnie znakowano 5 .g / ml skoniugowanego antygenu Alexa Fluor 488a anty-DNGR-1. lub kontrola izotypu IgG1 szczura przez 30 minut w temperaturze 4 ° C. W przypadku ludzkich DNGR-1 + DC, komórki po raz pierwszy zostały wzbogacone z całkowitych PBMC przy użyciu BDCA-3 PE i mikroperełek anty-PE (Miltenyi Biotec), a następnie sortowane w celu oczyszczenia komórek o wysokiej ekspresji BDCA-3, które następnie oznaczono jako 10 yg / ml skoniugowanej z Alexa Fluor 488P anty-ludzkiej DNGR-1 lub kontrolnej izotypowej mysiej IgG2a przez 30 minut w temperaturze 4 ° C. W obu testach myszy lub komórki ludzkie przemyto dwukrotnie, a następnie inkubowano przez 2 godziny w 4 ° C lub 37 ° C. Następnie komórki pozostawiono do przylegania do szkiełek nakrywkowych pokrytych poli-l-lizyną w temperaturze pokojowej, utrwalono w 2% paraformaldehydzie i zamontowano przy użyciu Fluoromount (SouthernBiotech). Konfokalna seria różniczkowych kontrastów interferencyjnych i obrazów fluorescencji została uzyskana przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego (Axioplan 2
[patrz też: dieta wrzodowa jadłospis, czerniak złośliwy rokowania, dom na przeklętym wzgórzu cda ]