Terapeutyczna supresja inicjacji translacji moduluje chemosensitivity w mysim modelu chłoniaka czesc 4

Komórki HeLa inkubowano ze wskazanymi stężeniami FA i silvestrolu przez godzinę, dodając [35S] metioninę 10 minut przed końcem inkubacji. Szybkość włączania [35S] metioniny (35S) -Met) wyraża się w stosunku do komórek traktowanych nośnikiem (MeOH). Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z 2 eksperymentów. (B) CBF wpływają przede wszystkim na syntezę białek in vivo. Komórki HeLa inkubowano z 5 .M FA, 0,4 .M silvestrolu lub podłożem (MeOH) przez godzinę. Szybkość wprowadzania każdego znacznika radioizotopowego do materiału nierozpuszczalnego w TCA wyraża się w stosunku do komórek traktowanych MeOH. Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z 2 eksperymentów. (C) Zahamowanie tłumaczenia przez CBF jest odwracalne. Komórki HeLa inkubowano przez godzinę z 10 .M anizomycyny, 5 .M FA, 0,4 .M silvestrolu lub MeOH. Komórki następnie przemyto PBS i inkubowano z podłożem bez związku przez wskazany czas. Dziesięć minut przed zbiorem do hodowli dodano [35S] metioninę. Szybkość wprowadzania [35S] metioniny do materiału nierozpuszczalnego w TCA wyraża się w stosunku do komórek traktowanych MeOH. Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z 3 eksperymentów. Anisomycyna działa jako kontrola pozytywna, ponieważ odzyskanie syntezy białka z hamowania za pomocą tego związku zachodzi w ciągu godziny po jego usunięciu z komórek (65). (D) CBF hamują translację zależną od nasadki in vivo. Top: Schematyczne przedstawienie wektora ekspresyjnego pcDNA / Ren / HCV / FF. Dół: wpływ FA na zależne od czapeczki i HCV translację IRES. W komórkach 293 transfekowanych pcDNA / Ren / HCV / FF. Aktywność lucyferazy wyrażana jest w stosunku do aktywności w komórkach traktowanych MeOH i jest średnia. SEM z 2 eksperymentów. (E) Silvestrol nie indukuje eIF2. fosforylacja. Komórki HeLa inkubowano przez 2 godziny w obecności nośnika (DMSO), thapsigargin (2 .g / ml) lub silvestrolu (400 nM), po czym ekstrakty analizowano metodą Western blotting. (F) Silvestrol indukuje apoptozę w stężeniach wyższych niż te wymagane do zahamowania syntezy białka. Komórki Jurkat inkubowano ze wskazanymi stężeniami silvestrolu przez 13 godzin, po czym zmierzono szybkość wbudowania [35S] metioniny lub procent żywych komórek. Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z 2 eksperymentów. Zdolność CBF do hamowania translacji zależnej od kapelusza in vivo oceniano monitorując wytwarzanie lucyferazy w komórkach transfekowanych bicistronowym reporterem pcDNA / Ren / HCV / FF w obecności FA (Figura 3D). Translacja zależna od nasadki była zaburzona przez CBF, podczas gdy translacja z udziałem HCV i IRES. Była nieznacznie stymulowana in vivo (Figura 3D). Wpływ CBF na translację in vivo nie wynikał z degradacji mRNA lub aktywacji tajemniczego promotora w IRES, ponieważ integralność mRNA nie uległa zmianie w komórkach po ekspozycji na związek (dodatkowa Figura 4). Ponadto, od związków, które indukują lub utrzymują eIF2. fosforylacja silnie hamuje syntezę białek, oceniliśmy zdolność silvestrolu do indukowania tego zdarzenia in vivo. Traktowanie komórek HeLa thapsigarginem (induktorem stresu ER) lub silvestrolem silnie hamowało syntezę białek (dodatkowa Figura 5). Podczas gdy thapsigargin wywołał eIF2. fosforylowanie (figura 3E, porównanie pasa 2 z linią 1), silvestrol nie (porównaj ścieżkę 3 z ścieżką 2) w stężeniach wystarczających do zahamowania syntezy białka. Te wyniki wskazują, że hamowanie syntezy białka związanego z silvestrolem in vivo nie jest konsekwencją eIF2. fosforylacja. CBF uprzednio wykazano, że są zdolne do indukowania apoptozy (24). Aby ocenić wymaganą dawkę dla tego zdarzenia w porównaniu do tej wymaganej do hamowania translacji, komórki Jurkat eksponowano na różne stężenia silvestrolu i monitorowano translację i śmierć komórek. Przy 80 nM, apoptoza wywołana przez silvestrol w około 50% komórek Jurkat po 13-godzinnej ekspozycji (Figura 3F). Jednak znacznie niższe stężenie silvestrolu było wystarczające do hamowania syntezy białka w tym wydłużonym okresie czasu (IC50, nM) (Figura 3F). Wyniki te wskazują, że wpływ CBF na translację in vivo nie jest pośrednią konsekwencją wyzwalania apoptozy. CBF powodują zależną od RNA sekwestrację eIF4A in vivo. Biorąc pod uwagę zdolność silvestrolu do stymulowania aktywności eIF4A wiążącej RNA in vitro, chcieliśmy ustalić, czy podobny mechanizm działa w warunkach in vivo. W konsekwencji pozycja migracji eIF4A była monitorowana w profilach polisomów generowanych z komórek Jurkat traktowanych silvestrolem lub podłożem (Figura 4). Profile uzyskane w obecności silvestrolu były zgodne z tym związkiem, hamując inicjację translacji i pozwalając na spływ rybosomów (Figura 4A)
[hasła pokrewne: dom na przeklętym wzgórzu cda, cysta naskórkowa, szpik w kości krzyżówka ]