Terapeutyczna supresja inicjacji translacji moduluje chemosensitivity w mysim modelu chłoniaka ad

Wyniki te sugerują strategię mającą na celu zmianę wrażliwości na leki w nowotworach poprzez ukierunkowanie na inicjację translacji. Wyniki CBF są nowymi inhibitorami translacji zależnej od nasadki. W trakcie kampanii badania przesiewowego małych cząsteczek, mającej na celu identyfikację nowych inhibitorów translacji eukariotycznej (23), stwierdzono, że klasa naturalnych produktów, CBF (znana również jako rokwamaryny) wywiera silną aktywność hamującą. Członkowie tej rodziny są znani z cytotoksyczności (22, 24-28) i hamują syntezę białek (25, 29), ale ich cel (y) molekularny i sposób działania są nieznane. Zidentyfikowano dwa CBF, 1-O-formyloblafolinę (FA, znany również jako ropaglate 1-O-formylometylu) i silvestrol (22) (Figura 1A) i wykazano zależne od dawki hamowanie zależnej od kapelusza lucyferazy świetlika (FF) translacji, ale tylko umiarkowany efekt (~ 2-krotny spadek) na wewnętrznym, pośredniczonym przez HCV miejscu wiązania z miejscem wiązania rybosomu (HCV, w których pośredniczy IRESa) translacja lucyferazy Renilla (Ren) w teście translacji in vitro (Figura 1, B i C; w celu hamowania FF, odpowiednio około 4 ^ M i 0,3 (M dla FA i silvestrolu) (patrz Omówienie wyjaśnienia efektu translacji za pośrednictwem HCV IRES.). Rocaglates są aktywne w kilku różnych systemach wolnej translacji komórek eukariotycznych (Rysunek i Suplementowa Figura 1, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI34753DS1), a silvestrol był około 10-krotnie silniejszy niż FA (Ryc. 1, B i C). Wyniki te sugerują, że CBF preferencyjnie są ukierunkowane na translację zależną od kapslów. Rycina 1CBF hamuje translację zależną od nasadki. (A) Struktura chemiczna FA i silvestrolu. (B) FA i silvestrol hamują translację zależną od czapeczki. Top: Schematyczne przedstawienie mRNA FF / HCV / Ren. Dół: zależne od dawki hamowanie syntezy białka zależnej od kapslowania przez FA i silvestrol w ekstraktach translacji Krebsa-2 zaprogramowanych mRNA FF / HCV / Ren (10 .g / ml). Wyniki aktywności lucyferazy (RLU) wyrażono względem wartości uzyskanych w obecności kontroli nośnika (MeOH). Wyniki wyrażono jako średnie. SEM z 2 eksperymentów. (C) Reprezentatywny autoradiogram z translacji in vitro przeprowadzony w ekstraktach Krebsa-2 z [35S] metioniną i zaprogramowany mRNA FF / HCV / Ren. Położenie migracji białek FF i Ren wskazano po prawej stronie. CBF celują w eIF4A i hamują inicjację translacji. Aby zidentyfikować etap translacji docelowej przez CBF, zmierzyliśmy wpływ tych związków na fazę rekrutacji rybosomów inicjacji translacji. W obecności inhibitora wydłużania cykloheksimidu, kompleksy 80S były uwięzione w kodonie AUG na znakowanych radioaktywnie matrycach mRNA i można je było rozdzielić przez wirowanie z prędkością sedymentacji (Figura 2A). FA hamował tworzenie kompleksu inicjacji 80S i powodował równoczesny wzrost wolnego mRNA, co wskazuje na upośledzenie rekrutacji rybosomów (Figura 2A). Figura 2CBF hamuje inicjację translacji i stymuluje aktywność wiązania RNA EIF4A. (A) CBF uniemożliwiają tworzenie kompleksu 80S. MRNA CAT znakowanego [32P] (200 000 cpm) inkubowano z cykloheksymidem (CHX) w obecności FA lub nośnika (MeOH) w lizatach króliczych retikulocytów. Reakcje rozdzielono przez odwirowanie przez gradienty glicerolu. Po odwirowaniu zebrano frakcje i oznaczono poziom radioaktywności przez zliczanie scyntylacji cieczy. Całkowite zliczenia odzyskane z każdego gradientu i odsetki mRNA związanego w kompleksach 80S były następujące: mRNA CAT / CHX + MeOH: 35178 cpm, 19% wiązania; i mRNA CAT / CHX + FA: 37655 cpm, wiązanie 2%. (B) CBF stymulują sieciowanie eIF4A do mRNA. Preparaty czynnika inicjacji usieciowano mRNA znakowanym [32P] -kapem w nieobecności (linia 2) lub obecności ATP (ścieżki i 3. 6), 0,6 mM m7GDP (ścieżka 3), 0,6 mM GDP (ścieżka 4). ), MeOH (linia 5) lub 50. M FA (linia 6). Po trawieniu nukleazą próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE, a żel poddano autoradiografii. Pozycja migracji eIF4E, eIF4A i eIF4B jest wskazana i opiera się na ich znanym zachowaniu w tym teście (30). (C) CBF stymulują aktywność wiązania eIF4AIf z RNA. MRNA znakowany [32P] -kapsem był usieciowany z rekombinowanym eIF4Alf w obecności MeOH (linia 1), 50 .M FA (linia 3) lub 50 .M silvestrolu (linia 2). Po trawieniu nukleazą próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE, a żel poddano autoradiografii. (D) CBF stymulują aktywność wiążącą RNA eIF4Ac. MRNA znakowany [32P] -kapsem był usieciowany z eIF4F w obecności MeOH (linia 1) lub 50 .M FA (linia 2). Po trawieniu nukleazą próbki rozdzielono metodą SDS-PAGE, a żel poddano autoradiografii
[przypisy: dieta kopenhaska jadłospis pdf, cukrzyca typu lada, czerniak złośliwy rokowania ]