Terapeutyczna supresja inicjacji translacji moduluje chemosensitivity w mysim modelu chłoniaka ad 8

Co więcej, nadekspresja Pdcd4 w naskórku opóźnia wystąpienie nowotworu i progresję w chemicznie indukowanym mysim modelu nowotworu skóry (21). Ektopowa nadekspresja eIF4G i eIF4E jest również onkogenna (6,7), a poziomy podjednostki eIF4E są podwyższone w wielu nowotworach ludzkich i zostały zaproponowane jako niezależny prognostyczny marker nowotworu dla raka sutka (52, 53). Odwrotnie, poziomy 4E-BP1, ujemnego regulatora eIF4E, odwrotnie korelują z progresją raków okrężnicy (54). eIF4E jest także genetycznym modyfikatorem odpowiedzi rapamycyny in vivo (10). Oporność na rapamycynę jest nowym złożonym i ważnym problemem klinicznym (55), który, jak się sądzi, częściowo wynika z osłabienia przez rapamycynę pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego od S6K do IRS-1, co prowadzi do aktywacji sygnalizacji IGF-1 (i Akt). Miałoby to niepożądaną konsekwencję zmniejszania działania przeciwnowotworowego inhibitorów mTOR (56). Częstość występowania tego mechanizmu w przypadku ludzkich nowotworów nie jest znana. Długotrwała ekspozycja na rapamycynę jest również ukierunkowana na kompleks białkowy rytora / mTOR (mTORC2) i prowadzi do zahamowania Akt S473 w pierwotnych ostrych białaczkach szpikowych (57. 59). Ekspozycja na rapamycynę chłoniaków Pten + / AE y-myc nie zwiększała poziomów p-Akt, co wskazuje, że pętla S6K / IRS-1 nie działa w przypadku chłoniaków Pten + / yE y-myc (Figura 5D i niepublikowane obserwacje). Nasze eksperymenty nie odnoszą się do zdolności CBF do odwracania ogólnej oporności na rapamycynę, ale sugerują, że w sytuacjach, w których jest to wynikiem podwyższonej ekspresji eIF4E, CBF mogą być korzystne. Ponadto bezpośrednie ukierunkowanie eIF4A przez CBF nie miało bezpośredniego wpływu na pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego S6K / IRS-1 lub fosforylację Akt ukierunkowaną na mTORC2 (Figura 5D), potencjalnie nadając CBF korzyści w porównaniu z rapamycyną w komórkach uczulających na chemioterapię. CBF zapobiegały wzrostowi ludzkich komórek Jurkat (Figura 3F) i LNCaP w hodowli (27, 60) i wykazały obiecujące efekty w modelach nowotworów ksenoprzeszczepów (25), ale ich zdolność do synergii z innymi czynnikami cytotoksycznymi nie była wcześniej badana. Jako pojedynczy czynnik, silvestrol był nieskuteczny w stosunku do chłoniaków E (3-myc niosących zmiany PTEN lub nadeksprymujących eIF4E (Figura 5, A i C). Może to wynikać z faktu, że obserwowano jedynie częściowe hamowanie syntezy białka po podaniu silvestrolu in vivo w porównaniu z eksperymentami in vitro (Figura 5E). Ten poziom zahamowania może być wystarczający do ograniczenia przekazywania sygnału przez przełyku, ale poniżej progu wymaganego do zatrzymania proliferacji komórkowej. Jednakże, w połączeniu z doksorubicyną, silvestrol był skuteczny przeciwko nowotworom Pten + / P Ea-myc i E . -Myc / eIF4E, które są oporne na leczenie rapamycyną / doksorubicyną. Nie wierzymy, że wrodzona cecha chłoniaków E. -Myc czyni je szczególnie wrażliwymi na działanie kombinacji silvestrol / doksorubicyna, ponieważ chłoniaki E. -Myc / Bcl2 nie były wrażliwe na tę kombinację leków (Figura 5B). Nasze wyniki potwierdzają pogląd, że ograniczenie inicjacji translacji poprzez modulowanie aktywności eIF4A jest obiecującym podejściem do zmiany oporności na leki związanej z aktywacją PI3K / mTOR. Metody Łączenie izolacji, syntezy i przechowywania. FA wyizolowano z korzeni Aglaia australiensis CM Pannell (HG 662) zebranych w Atherton Tablelands, Queensland, Australia. Ekstrakt metanolowy rozdzielono pomiędzy wodę i chloroform, frakcję lipofilową oddzielono za pomocą preparatywnej średniociśnieniowej chromatografii cieczowej i chromatografii cienkowarstwowej, jak opisano wcześniej (61). FA również syntetyzowano chemicznie przy użyciu poprzednio opisanej syntetycznej drogi (62). Syntetyczna pochodna i produkt naturalny wykazywały równoważną siłę w testach hamowania translacji. Silvestrol był dobrym prezentem od Murraya Taita (Cerylid Biosciences Ltd., Richmond, Victoria, Australia) (63). FA i silvestrol ponownie zawieszono w metanolu i przechowywano w temperaturze <70 ° C. Doksorubicynę (Sigma-Aldrich) rozpuszczono w wodzie i przechowywano w 4 ° C. Rapamycynę (LC Laboratories) zawieszono ponownie w 100% etanolu i przechowywano w temperaturze ~ 70 ° C. Transkrypcja in vitro i tłumaczenie. W przypadku transkrypcji in vitro plazmidy pKS / FF / Ren, pKS / FF / EMCV / Ren i pKS / FF / HCV / Ren linearyzowano BamHI i transkrybowano polimerazą RNA T3 w celu wytworzenia mRNA. Translacje in vitro przeprowadzono z użyciem ekstraktów Krebsa-2 przy końcowym stężeniu mRNA i K + odpowiednio 5 .g / ml i 100 .M (23). Aktywności FF i Ren (RLU) zmierzono na luminometrze Lumat LB 9507 (Berthold Technologies). Po translacji in vitro w obecności [35S] metioniny, produkty białkowe rozdzielano na 10% żelach poliakryloamidowych / SDS, które traktowano EN3HANCE (PerkinElmer), suszono i eksponowano na folię X-Omat (Kodak). Hodowle komórkowe, transfekcje, testy lucyferazy i apoptozy [patrz też: dehydratacja krążków międzykręgowych leczenie, czepota puszysta, szpik w kości krzyżówka ]