W poniższych badaniach, rygorystycznie badaliśmy rolę VAMP8 w każdym z exocytotycznych zdarzeń komórki trzustkowej trzustki w kontekście tego alkoholowego modelu zapalenia trzustki. Regulowane wydzielanie enzymów jest zmniejszone, ale nie usunięte w Vamp8. /. acini i jest dodatkowo redukowany przez wstępne traktowanie EtOH. Najpierw zbadano wpływ delecji VAMP8 na wydzielanie amylazy stymulowane przez Cch i EtOH. Jak wcześniej podano (15, 20), potwierdziliśmy brak białka VAMP8 w zdyspergowanym trzustkowym akcynie Vamp8a /. myszy (Figura 3A i analiza na uzupełniającej Figurze 1). Ponadto zwiększono ekspresję białka VAMP2, co jest zgodne ze wzrostem liczby ZG. Wcześniej wykazano, że h jest optymalnym czasem dla submaksymalnego Cch (3 (3M) w celu maksymalnego uwolnienia amylazy z rozproszonego trzustkowego trzustki, a h to minimalny czas preinkubacji z 20 mM EtOH, przed dodaniem 3. M Cch, w celu osiągnięcia maksymalnego hamowania 3. M wydzielania amylazy stymulowanej przez Cch (6, 7). EtOH 20 mM jest stężeniem znajdującym się w zakresie stężenia alkoholu we krwi obserwowanym podczas klinicznego zatrucia alkoholem (5) i naszego alkoholowego modelu zapalenia trzustki (Tabela 4), ale był niewystarczający, aby niezależnie stymulować wydzielanie amylazy (6. 8). W przypadku noworodków trzustki VAMP8 wykazano wyższą aktywność amylazy w porównaniu z normalnymi noworodkowymi trzustkami (15). Dlatego przeanalizowaliśmy to u dorosłych myszy z grup CD i ED, znajdując Vamp8. /. trzustki wykazują 2-krotny wzrost (P <0,05) w aktywności amylazy (w jednostkach arbitralnych, odpowiednio 2,1. 0,4 i 2,3. 0,4) w porównaniu z trzustkami WT (odpowiednio 1,0. 0,2 i 1,1. 0,2) (Figura 3B) . Figura 3C bada wydzielanie amylazy (wyrażonej jako procent całkowitej amylazy) WT i Vamp8. /. acini, które były lub nie były wcześniej traktowane 20 mM EtOH (1 h), w odpowiedzi na submaksymalną Cch (3 (3M), maksymalną (80 (M) i supramaksymalną (2 mM) stymulację (1 h). Przy braku wstępnej obróbki EtOH, regulowane uwalnianie amylazy było znacznie zmniejszone w Vamp8a /. acini w porównaniu z WT acini po stymulacji submaksymalnym (3 (3 M Cch, h, WT, 19,4% -1,6%, Vamp8a / p, 6,8%> 0,7%) i maksymalnym Cch (80 (x M Cch, godz; WT 31,2%, 2,2%, Vamp8a / P, 12,0%, 1,4%), co stanowi zmniejszenie odpowiednio o 65,0% i 62,2% (P <0,05). Te wyniki różnią się od naszych początkowych badań (15), które wykazały, że pobudzony sekrecją wydzielanie w Vamp8. /. Acini został w dużej mierze zniesiony. Wyższe poziomy podstawowej amylazy w poprzednim badaniu sugerują, że zastosowane preparaty trzustkowe i młodszy wiek myszy nie były optymalne, a zatem były znacznie mniej wrażliwe na stymulację niż poziomy podstawowej amylazy w bieżącym badaniu. Sam 20 20 sam EtOH nie stymulował znacznego uwalniania amylazy (WT, 2,2%. 0,9%, Vamp8a / p, 1,5% . 0,5%) w porównaniu z poziomami podstawowymi (kontrola Krebsa-Ringer-HEPES [KRH], WT, 2,0%. 0,7%, Vamp8a /, 1,4%, 0,6%). Zadziwiająco, acini z obu WT i Vamp8. /. myszy traktowane wstępnie 20 mM EtOH (1 godz.) znacznie zmniejszono uwalnianie 3 | jM i 80 | jM Cch o 40% . 50% (P <0,05). Aby pokazać, że wywołana sekrecja była wynikiem stymulacji Cch, preinkubacja acini z Atp (1.M Atp, h) blokowała wydzielanie amylazy stymulowane przez Cch i EtOH / Cch przez porównywalną redukcję o 49,2% i 50,7% w Myszy WT i 45,6% i 47,2% w Vamp8. /. myszy, odpowiednio (dane nie pokazane). Wiadomo, że supramaksymalne Cch powoduje hamowanie sekrecji, co w istocie miało miejsce w przypadku 2mM stymulowanego przez Cch uwalniania w WT (10,3%. 0,9%) i Vamp8. /. acini (3,6%, 0,7%). W przeciwieństwie do submaksymalnego i maksymalnego Cch, wstępne traktowanie EtOH nie spowodowało dalszego zahamowania sekrecji ze stymulowanego 2 mM Cch (odpowiednio 9,8% <0,8% i 3,5%> 0,6% w WT i Vamp8a / y). Figura 3 Ograniczone wydzielanie enzymu jest zmniejszone, ale nie usunięte w Vamp8a /. acini i wykazuje dalszą redukcję przy wstępnej obróbce alkoholem. (A) Western blot pokazujący, że VAMP8 jest nieobecny w Vamp8. /. mysią tkankę trzustki, podczas gdy poziomy VAMP2 są zwiększone. Białko (10 (ig) każdej frakcji rozdzielono na SDS-PAGE i poddano immunoblottingowi przeciwciałami przeciwko VAMP8, VAMP2 i aktyną. Reprezentant 3 niezależnych eksperymentów, n = 3 (analiza pokazana na suplementowej figurze 1). (B) Akumulacja amylazy w Vamp8. /. trzustki. Aktywność amylazy dorosłych WT i Vamp8. /. trzustki zostały określone i przedstawione jako jednostki arbitralne. Każda wartość jest średnia. SD z trzech próbek na eksperyment z 5 niezależnych doświadczeń (n = 15). * P <0,05 w porównaniu z myszami WT. (C) Wpływ 20 mM EtOH (1 godz. Preinkubacji) na submaksymalne (3. M, godz.), Maksymalne (80. M, godz.) I supramaksymalne (2 mM, godz.) Stymulowane Cch uwalnianie amylazy w WT i. Vamp8. /. acini [więcej w: erytrocyty w cytologii, tureckie allegro, dyslipidemia aterogenna ]