VAMP8 to v-SNARE, który pośredniczy w egzocytozie podstawno-bocznej w mysim modelu alkoholowego zapalenia trzustki ad 9

Jest to zgodne z VAMP8 promującym egzocytozę na podstawowym PM (Figura 5, C. E) i bocznym PM (Figura 6). Jako kontrolę, wstępne traktowanie 1. M Atp blokowało zarówno spychanie wywołane przez Cch zamplifikowanych przez VAMP8 ZG w wierzchołkowym biegunie i indukowaną EtOH / Cch redystrybucję znakowanych VAMP8 ZG do podstawno-PM (dane nie pokazane). Figura 8 VAMP8 jest redystrybuowany do boczno-bocznego PM w WT acini po stymulacji EtOH plus Cch. Reprezentatywne obrazy konfokalne lokalizacji VAMP8 w rozproszonej trzustce z myszy WT. Acini inkubowano wstępnie w KRH lub 20 mM EtOH przez godz., A następnie stymulowano 3 (3 M Cch przez 20 min lub dalej inkubowano przez 15 min z KRH. Acini zostały następnie naprawione i podwójnie oznakowane dla VAMP8 (czerwone w połączonych obrazach) i actin (zielone w połączonych obrazach). Strzałka i grot strzałki wskazują VAMP8-dodatnie struktury podobne do ZG umiejscowione w pobliżu bazowych i bocznych powierzchni PM, odpowiednio. Skalowane pręty: 10 .m. VAMP8 tworzy odrębne trójskładnikowe kompleksy SNARE, które pośredniczą w egzocytozie podstawno-bocznej i fuzji ZG-ZG. Wcześniej informowaliśmy, że egzocytoza podstawno-boczna w zdyspergowanych komórkach groniastych trzustki stymulowanych supramaksymalnym CCK lub 20 mM EtOH plus submaksymalna CCK lub Cch (3. M Cch) obejmowała kompleks SNARE Syn-4 / SNAP-23 / VAMP i Munc18c (6. 8) . Aby Syn-4 stał się podatny na montaż za pomocą SNAP-23 i VAMP, fosforylacja Munc18c przez PKCa była wymagana do indukowania przesunięcia Munc18c i aktywacji Syn-4 (6, 7). Munc18c został przemieszczony do cytozolu, a następnie ulegał degradacji proteolitycznej (4, 6. 8), co wyjaśnia niższe poziomy stwierdzone w całkowitych lizatach. W tym miejscu ustaliliśmy losy tego basolateral PM SNARE w zdyspergowanych acini stymulowanych przez te warunki po usunięciu VAMP8 (Figura 9A i dodatkowa Figura 3A). W warunkach podstawowych (KRH), immunoprecypitowany Syn-4 z frakcji PM wiązał się silnie z Munc18c zarówno WT, jak i Vamp8. /. acini, a Syn-4 nie wiązałoby pokrewnych białek SNARE SNAP-23 lub VAMP. W obu grupach 20 mM EtOH plus 3. M stymulacja Cch powodowało równomierną redukcję poziomów PM Munc18c (wskazując na przesunięcie do cytosolu), co umożliwiło wiązanie Syn-4 z SNAP-23, i te zdarzenia nie były zaburzone przez delecję VAMP8. Te początkowe zdarzenia sprawiły, że boczny PM był wyjątkowo podatny na montaż za pomocą ZAMP VAMP. Rzeczywiście, w WT acini, fuzja ZG z boczno-bocznym PM wywołała montaż z VAMP8, co jest zgodne z redystrybucją VAMP8 do bazo-bocznego PM pokazanego na Figurze 8. Nieobecność VAMP8 w Vamp8. /. acini uniemożliwił utworzenie tego kompleksu SNARE, co wyjaśnia brak egzocytozy podstawno-bocznej. Wydaje się, że kompleks Syn-4 / SNAP-23 wiąże się z VAMP2 w Vamp8. /. acini nie zwiększył się ponad WT acini pomimo wyższych poziomów VAMP2, które wynikały z większej liczby ZG w Vamp8. /. acini. Figura 9VAMP8 tworzy odrębne trójskładnikowe kompleksy SNARE, które pośredniczą w egzocytozie podstawno-bocznej i fuzji ZG-ZG. Rozproszony acini z WT i Vamp8. /. myszy traktowano następującymi warunkami: kontrolny bufor KRH (2 godz.), bufor KRH (1 godz.), a następnie 20 mM EtOH (1 godz.), bufor KRH (1 godz.), a następnie 3 um Cch (1 godz.), lub 20 mM EtOH (1 h), a następnie 3 (3 M Cch (1 h). Następnie z tych acini przygotowano frakcje membranowe PM i ZG. Białko (200 .g) oczyszczonego PM poddano immunoprecypitacji z użyciem przeciwciał (A) anty-Syn-4 (WT i Vamp8a / mysia acini) lub (B) przeciwciał anty-Syn-2 (tylko WT) i 200 .g. białko oczyszczonych błon ZG poddano immunoprecypitacji przeciwciałami anty-Syn-3 (C) anty-Syn-3 (tylko WT). Wytrącone białka rozdzielano na SDS-PAGE i identyfikowano ze wskazanymi przeciwciałami. Całkowite lizaty (8 g białka) służące jako kontrole wejściowe wykazywały podobne poziomy białek SNARE w różnych terapiach, z wyjątkiem Munc18c, VAMP2 i VAMP8 w A. Te bloty są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów z próbkami wykonanymi w dwóch powtórzeniach i analizach. są pokazane na Uzupełniającej Figurze 3. Ponieważ Syn-2 wyłącznie lokalizuje się do apikalnego PM i postulowano go do pośredniczenia w egzocytozie wierzchołkowej, to znaczy fuzji ZG w jądrze PM per se (10, 11, 31), zbadaliśmy, czy endogenna syn- 2 immunoprecypitowane z frakcji PM tworzą kompleksy z VAMP2 i / lub VAMP8 w WT acini (Figura 9B). Z 3.M Cch, który stymulował egzocytozę wierzchołkową, Syn-2 nie współstradował VAMP8, ale silnie wytrącił VAMP2 (i SNAP-23). Jednakże w niestymulowanym acini (KRH) Syn-2 nie wiązał VAMP2 lub SNAP-23, ale zamiast tego silnie związał się z Munc18b (32). Dopiero po stymulacji Cch włączono (lub aktywowano) Syn-2 w celu związania VAMP2 i SNAP-23, czemu towarzyszyło dysocjowanie Munc18b z PM
[przypisy: dlaczego psy nie mogą jeść czekolady, tureckie allegro, dychawica krzyżówka ]