Utrata ciąży w zespole antyfosfolipidowym – możliwy mechanizm trombogenny cd

Oprócz krótkookresowych hodowli w temperaturze 4 ° C, komórki śródbłonka żyły pępowinowej hodowano również z frakcjami IgG w 37 ° C przez 20 godzin, po czym komórki przemywano raz w buforze HEPES zawierającym 5 mM chlorek wapnia i następnie przemywano buforem HEPES zawierającym mM EGTA w miejsce wapnia, aby zdysocjować aneksynę V. na powierzchni komórki. Poziomy aneksyny V określano za pomocą testu immunoabsorpcji enzymatycznej, jak opisano powyżej. Dodatkowo, w badaniach krzepnięcia z osoczem, równoległe hodowle komórek śródbłonka żyły pępowinowej inkubowano z frakcjami IgG w 37 ° C przez 20 godzin, płukano raz w buforze HEPES zawierającym 5 mM chlorek wapnia, a następnie testowano jak opisano poniżej. Sekcja. Do wszystkich badań wykorzystano czterokrotne studzienki hodowlane. Badania krzepnięcia
Po hodowaniu komórek do konfluencji w 96-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej, badania krzepnięcia przeprowadzono w następujący sposób: komórki najpierw przemyto trzykrotnie buforem HEPES zawierającym 5 mM chlorek wapnia, a następnie inkubowano z antyfosfolipidem lub kontrolnym IgG. (5 mg na mililitr) w pożywce podstawowej plus 10% surowicy płodowej dla cieląt przez 90 minut w temperaturze 4 ° C. Po płukaniu w buforze HEPES, komórki pokryto normalnym połączonym osoczem (100 .l na studzienkę) ponownie zmętniało z 11 .l 70 mM chlorku wapnia w przypadku komórek BeWo. Konieczne było dodanie takiej samej objętości 200 mM chlorku wapnia, aby obserwować koagulację osocza w przypadku komórek śródbłonka żył pępowinowych. Do wszystkich badań wykorzystano czterokrotne studzienki hodowlane.
Płytki hodowlane umieszczono następnie w czytniku kinetyczno-płytkowym do mikromiareczkowania i obserwowano tworzenie fibryny jako wzrost gęstości optycznej do 0,100 przy długości fali 405 nm. Potwierdziliśmy, że test ten rzeczywiście monitoruje tworzenie fibryny przez określenie, że dodaje heparynę śluzową jelita wieprzowego (0,5 U na mililitr) (Steris Laboratories, Phoenix, Ariz.) Lub rekombinowaną hirudynę (0,5 .g na mililitr) (uprzejmie dostarczona przez Ciba- Geigy, Summit, NJ) do plazmy całkowicie zahamowały wszelkie zmiany gęstości optycznej. Ponadto, przy braku heparyny lub hirudyny, tworzenie się żelu fibrynowego można było obserwować gołym okiem.
Próbowaliśmy również ustalić, czy zredukowanie aneksyny V na powierzchni komórki bez przeciwciał antyfosfolipidowych może wpływać na koagulację osocza. Przeprowadziliśmy zatem eksperymenty, w których komórki śródbłonka żyły pępowinowej, które nie były inkubowane z ludzkimi frakcjami IgG, płukano w buforze HEPES zawierającym 5 mM chlorek wapnia i EGTA, w celu zachowania lub dysocjacji powierzchniowej aneksyny V. Następnie komórki śródbłonka żyły pępowinowej inkubowano z królicze przeciwciała poliklonalne anty-aneksyny V IgG (100 .g na mililitr) przez 90 minut w temperaturze 4 ° C, po czym nało.ono je na odwapnione osocze i zmierzono czas do koagulacji. Kontrole obejmowały równoważne stężenia poliklonalnej króliczej anty-aneksyny II IgG (uprzejmie dostarczone przez Dr Katherine Hajjar, Cornell University Medical College) i poliklonalne królicze anty-mysie idiotypy IgG (uprzejmie dostarczone przez Dr. Thomasa Morana, Mount Sinai School of Medicine).
Ponadto komórki śródbłonka żyły pępowinowej płukane trzy razy w buforze HEPES, który zawierał 5 mM chlorek wapnia, w celu zachowania aneksyny z powierzchni komórki V, porównywano z komórkami, które przemyto trzy razy w buforze HEPES zawierającym mM EGTA, w celu zdysocjowania komórek. powierzchnia aneksyna V
[patrz też: monoderma, ambrisentan, agaricus ]
[więcej w: dolargan ulotka, dychawica krzyżówka, dyslipidemia aterogenna ]