Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad

Sugeruje to, że ukierunkowanie antygenu na DEC-205 może być przydatne do indukowania ochronnej odporności na CTL w takich chorobach, jak rak, malaria i HIV. Niestety, mysz DEC-205 jest nie tylko wyrażana w CD8 (3 + DC, ale także w podgrupach cDC węzłów chłonnych, komórkach Langerhansa, śródmiąższowych DC, komórkach nabłonka grasicy i na niższych poziomach, w komórkach B, makrofagach, limfocytach T i granulocytach. (38, 40. 42). Human DEC-205 pokazuje jeszcze szerszą dystrybucję (43). Dlatego też inne receptory, które mogłyby selektywnie umożliwić celowanie mysich CD8a + DC in vivo lub ich odpowiedników u ludzi, byłyby pożądanym dodatkiem do repertuaru docelowych DC dla indukowania odporności na CTL. Tutaj opisujemy DC, receptor IL-1 receptora NK (DNGR-1) jako uprzednio niescharakteryzowaną lektynę typu C, która jest selektywnie eksprymowana w mysich CD8 (3 + cDC i, na niskich poziomach, na pDC, ale nie w innych typach komórek. Pokazujemy, że DNGR-1 działa jako receptor endocytowy, który może pośredniczyć w internalizacji związanego przeciwciała i może być ukierunkowany na dostarczanie antygenu in vivo do CD8a + DC. Umożliwia to krzyżową prezentację komórkom T CD8 + i wraz z adiuwantem indukuje silne odpowiedzi CTL, które mogą wyleczyć myszy z przeszczepialnego guza. Warto zauważyć, że DNGR-1 jest również selektywnie ekspresjonowany w małej podgrupie ludzkich DC. Tak więc DNGR-1 stanowi selektywny marker dla ludzkich i mysich podzbiorów DC i może być wykorzystany do dostarczania antygenu do tych komórek in vivo. Wyniki Identyfikacja i charakterystyka DNGR-1. Aby zidentyfikować markery dla podzbiorów DC myszy, przeprowadziliśmy reprezentacyjną analizę różnicową świeżo wyizolowanej śledziony myszy CD11c + CD8 (3 + i CD11c + CD8. komórki (O. Schulz, DJ Pennington i C. Reis e Sousa, niepublikowane obserwacje). Sekwencje pasujące do klonu EST AW318446, odpowiadające mysiemu genowi lektyny typu C 9A (Clec9a), były wysoko reprezentowane wśród specyficznych transkryptów CD8 (3 + DC (nie przedstawiono danych). Adnotacja genomu przewiduje obecność genów CLEC9A w Mus musculus, Pan troglodytes, Homo sapiens, Canis lupus familiaris i Macaca mulatta. Wyszukiwanie w bazie danych wykorzystujące część sekwencji białkowej mysiej CLEC9A dalej sugeruje obecność genów CLEC9A w Rattus norvegicus i Bos taurus (44). CLEC9A jest przewidywany jako receptor transbłonowy typu II z rodziny lektyny typu C z pojedynczą zewnątrzkomórkową domeną lektynową typu C (CTLD) (dodatkowe dane i 2, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI34584DS1). CTLD zawiera 6 konserwowanych reszt cysteinowych, które prawdopodobnie biorą udział w tworzeniu wewnątrzłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych, jak również inne konserwatywne cechy CTLD (45), ale brakuje im aminokwasów ko-koordynujących aminokwasów występujących w typowych domenach rozpoznawania węglowodanów (dodatkowe rysunki i 2) . CTLD CLEC9A jest połączony z regionem łodygi zawierającym zachowaną cysteinę, która prawdopodobnie bierze udział w dimeryzacji (patrz poniżej). Następnie następuje region transbłonowy i domena cytoplazmatyczna z wysoce konserwatywną tyrozyną (dodatkowe rysunki i 2). Gen myszy zawiera 7 egzonów, podczas gdy człowiek zawiera 9 egzonów, z których 6 zostało opisanych jako przyczyniające się do mRNA (Suplementowa Figura 1). U myszy odkryliśmy transkrypty dla 3 izoform Clec9a (suplementowa figura 3), którą nazwaliśmy długą izoformą (eksony 1. 7), krótką izoformą (pozbawioną egzonu 4, ale zachowującą tę samą ramkę odczytu) i bardzo krótką izoformą (eksony). (3 sprzężone z eksonem 7, kodujące białko, które, jeśli ulega ekspresji, podzieliłoby domeny transbłonowe i wewnątrzkomórkowe z CLEC9A, ale miałoby krótką i różną domenę zewnątrzkomórkową). Opublikowana analiza sugeruje, że CTLD CLEC9A jest blisko spokrewniona z tą znalezioną w receptorze I lektyny komórek zabójcy (KLR-I) (44). Nasza analiza pokazuje, że pomimo wysokiego stopnia podobieństwa do KLR-I i innych członków kompleksu KLR, CLEC9A jest filogenetycznie najbliżej spokrewniony z CLEC7A, powszechnie znanym jako dectin-1 (Suplementowa Figura 4). Warto zauważyć, że zarówno CLEC9A i dectin-1, jak i KLR-I należą do grupy receptorowej komórek NK lektyn typu C (grupa V). Zgodnie z tym pojęciem i zgodnie z jego wzorem ekspresji ograniczonym przez DC u myszy i człowieka (patrz poniżej), nazwaliśmy białko DNGR-1. Sklonowaliśmy mysie cDNA DNGR-1 ze śledziony CD8y + DC. Badania transfekcji przy użyciu oznaczonej C-końcem wersji receptora wskazały, że można go ekspresjonować i transportować na powierzchnię komórki w komórkach heterologicznych (dane nie pokazane). Aby bardziej szczegółowo zbadać ekspresję, wygenerowaliśmy mAbs przeciwko DNGR-1 (patrz Metody). Wybraliśmy 3 szczurzych mAb anty-mysich DNGR-1 nazwanych 1F6, 397 i 7H11, które specyficznie wybarwiały komórki trwale transfekowane cDNA mDNGR-1 (Suplementowa Figura 5) i rozpoznały krótką i długą izoformę, które różnią się tylko w segmencie regionu łodygi (dane nie pokazane)
[patrz też: cytologia płynna, erytrocyty w cytologii, czy psy mogą jeść czekoladę ]