Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad 8

BDCA-3 + DC barwiono w temperaturze 4 ° C za pomocą znakowanego Alexa Fluor 488a anty-DNGR-1. Po godzinie w 37 ° C, ale nie w 4 ° C, wykryto fluorescencję w przedziałach wewnątrzkomórkowych (Figura 10). Dlatego też ludzki DNGR-1 pośredniczy w endocytozie związanego przeciwciała w BDCA-3 + DC, sugerując tym samym, że może on być użyty do kierowania antygenu do tych komórek u ludzi. Dyskusja Rośnie przekonanie, że DC stanowią heterogeniczną rodzinę złożoną z wielu podzbiorów o wyspecjalizowanych funkcjach (2). Sugeruje to, że strategie, które jednocześnie celują w wiele podtypów DC, mogą być kontrproduktywne, być może wywołujące konkurencyjne reakcje. Dlatego istnieje wyraźna potrzeba identyfikacji markerów, które mogłyby służyć do selektywnego manipulowania różnymi podtypami DC. Tutaj, donosimy, że uprzednio niesankcjonowana lektyna typu C CLEC9A, nazwana tutaj DNGR-1, jest wysoce specyficznym markerem podzbioru myszy i ludzkich DC i może być stosowana do dostarczania egzogennych antygenów do prezentacji MHC klasy I in vivo, pozwalając wydajne krzyżowanie wstępne i terapia nowotworów. Stosowanie reprezentacyjnej analizy różnicowej do porównywania mysich CD8 a + i CD8 DC, początkowo odkryliśmy, że transkrypty DNGR-1 były nadreprezentowane w CD8 + DC. DNGR-1 koduje receptor transbłonowy typu II z rodziny lektyn typu C, zawierający pojedynczą zewnątrzkomórkową CTLD i krótki wewnątrzkomórkowy ogon. Pokazujemy, że mysia wersja DNGR-1 ulega selektywnej ekspresji w CD8 (3 + cDC i na znacznie niższych poziomach w pDC niestymulowanych zwierząt. Warto zauważyć, że ludzka wersja DNGR-1 jest podobnie ograniczona w ekspresji do małego podzbioru DC krwi, zdefiniowanego przez ekspresję BDCA-3. Te BDCA-3 + DC zostały wcześniej opisane jako podtyp DC szpiku (50. 52) i mają podobieństwo do mysich CD8. + DC, w tym wysoki poziom mRNA TLR3, brak transkryptów TLR7 i ekspresja białka podobnego do nectin 2 (53-55). Jednak w przeciwieństwie do DNGR-1, BDCA-3 nie jest unikalnym markerem dla tej populacji, ponieważ jest również wyrażany w liniach innych niż DC. Bardzo ograniczona ekspresja DNGR-1 będzie zatem przydatna w określaniu, czy DNGR-1 + DC reprezentują długo poszukiwany ludzki odpowiednik mysich CD8 (3 + DC i w kierowaniu tych komórek u ludzi. Ograniczona ekspresja i właściwości endocytowe DNGR-1 sugerowały, że może on stanowić przydatny receptor do namierzania antygenów do CD8a + DC lub ich ludzkiego odpowiednika. Zgodnie z tym poglądem, pokazujemy, że przeciwciała przeciwko DNGR-1 specyficznie znakują CD8 (3 + DC i pDC u myszy, bez wykrywalnego barwienia innych leukocytów. Znakowanie wykryto w śledzionie nawet po miejscowym podaniu małych ilości przeciwciała (2 .g) do łapek stóp, co ilustruje niezwykłą zdolność przeciwciała do dyfuzji i wiązania specyficznego do odległych celów. Zgodnie z danymi na etykiecie, dostarczenie in vivo zmodyfikowanego peptydu OVA kowalencyjnie sprzężonego z przeciwciałem anty-DNRG-1 spowodowało selektywne dostarczanie antygenu do prezentacji krzyżowej MHC klasy I przez CD8y + DC. Brak prezentacji przez pDC nie jest nieoczekiwany, biorąc pod uwagę, że wyrażają one niskie poziomy DNGR-1 i zostały opisane jako słabo prezentujące krzyżowo APC (56). Jednakże nie można wykluczyć, że odzwierciedla to również ograniczenie naszego testu, ponieważ świeżo wyizolowane pDC śledziony umierają szybko i są słabymi stymulatorami komórek T OT-1 (dane nie pokazane). Niemniej jednak uważamy, że odpowiedzi immunologiczne wywołane przez ukierunkowanie anty-DNGR-1 in vivo przede wszystkim odzwierciedlają aktywność prezentującą antygen CD8 + DC. Fakt, że antygen ukierunkowany DNGR-1 p jest skutecznie krzyżowany z limfocytami T CD8 + wskazuje, że, podobnie jak receptor mannozowy i DEC-205 (24, 57), DNGR-1 może dostarczać ładunek do selekcji przedziałów endosomalnych, które krzyżują się z MHC. ścieżka przetwarzania i prezentacji klasy I. Jest to zgodne z obserwacją, że przeciwciało anty-DNGR-1 może być endocytozowane przez zarówno ludzkie jak i mysie DC i koncentruje się w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach, chociaż nie znamy obecnie specyficznej tożsamości takich przedziałów i czy internalizacja przeciwciała odzwierciedla konstytutywną endocytozę receptora lub wychwyt indukowany przez sieciowanie receptorów. To, czy celowanie DNGR-1 promuje prezentację MHC klasy II przez CD8 + DC, będzie interesującym zagadnieniem do dalszych badań. Koniugaty anty-DNGR-1 do białka OVA o pełnej długości wykazywały heterogenną masę cząsteczkową, co wykluczało określenie wartościowości, czystości i stechiometrii (D. Sancho i C. Reis e Sousa, niepublikowane obserwacje). Dlatego użyliśmy tych koniugatów tylko w ograniczonym zestawie eksperymentów, aby potwierdzić wyniki uzyskane dla anty-DNGR-1 sprzężonego z peptydami S1 lub S2 (np. Figura 6D).
[podobne: embolizacja naczyniaka, dolargan ulotka, erytrocyty w cytologii ]