Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad 7

Zsyntetyzowaliśmy biotynylowane peptydy obejmujące H-2Kb. i ograniczone anty-epitopy H-2Dbp z antygenowej glikoproteiny 100 specyficznej dla linii melanocytów (gp100), białko spokrewnione z tyrozynazą (TRP-1) i TRP-2 (47-49), sprzężone kowalencyjnie z anty-DNGR-1. i immunizowane myszy koniugatami przeciwciała razem z poli I: C i anty-CD40 jako adiuwantami. Jak pokazano na Figurze 8, pojedyncza dawka szczepionki podawana terapeutycznie 3 dni po przeniesieniu komórek czerniaka B16 indukowała prawie całkowitą eradykację pseudometastaz płuc. Towarzyszyła temu indukcja silnego IFN-y odpowiedzi na antygeny czerniaka (Figura 8). Przeciwnie, te same antygeny w postaci niezwiązanej (skoniugowane z kontrolnym izotypowo dopasowanym mAb) nie spowodowały ochrony lub IFN-y. odpowiedzi (rysunek 8). Podobne wyniki otrzymano w modelu profilaktycznym, w którym szczepionkę podano przed prowokacją B16 (dodatkowa figura 9). Wnioskujemy, że priming swoistego CTL poprzez celowanie DNGR-1 może być stosowany do profilaktycznego lub terapeutycznego szczepienia przeciwko nowotworom myszy. Figura 8Immunoterapia czerniaka B16 poprzez celowanie antygenów nowotworowych do DNGR-1. (A) Eksperymenty z terapią guza przeprowadzono jak przedstawiono (górny panel) przy użyciu peptydów obejmujących znane epitopy endogennych antygenów melanocytów różnicujących (Endo: gp100, TRP-1 i TRP-2) kowalencyjnie sprzężonych z anty-DNGR-1 lub z dopasowane do izotypu przeciwciało kontrolne. Jako adiuwant stosowano Poly I: C plus anty-CD40. Dolny lewy panel pokazuje reprezentatywne fotografie płuc od myszy traktowanych jak wskazano. Prawy panel pokazuje kwantyfikację guzów płuc u każdej myszy. Dane są zbierane z 2 niezależnych eksperymentów (n = 9 myszy / grupa), a każdy punkt reprezentuje mysz. (B) Splenocyty z poszczególnych myszy przedstawionych w A ponownie stymulowano in vitro peptydami antygenowymi różnicowania melanocytów stosowanymi do immunizacji (10 .M). IFN-. poziomy po 2 dniach hodowli są pokazane. Dane zebrano z 2 niezależnych doświadczeń (n = 9 myszy / grupę). Wartości P obliczono stosując test U Manna-Whitneya. Ludzki DNGR-1 jest receptorem endocytarnym ograniczonym do małego podzbioru DC krwi. Aby rozszerzyć te odkrycia na ludzi, sklonowaliśmy hDNGR-1 i wygenerowaliśmy mysie mAb przeciwko niemu (patrz Metody). Jedno z tych mAb zostało wybrane do analizy wzoru ekspresji DNGR-1 wśród ludzkich jednojądrzastych komórek krwi obwodowej. Ludzka ekspresja DNGR-1 była nieobecna w limfocytach, monocytach, komórkach NK i negatywnym w linii komórkowej, HLA-DR. komórki (Figura 9A). Nie wykryto tego również w DC pochodzących z monocytów wytworzonych przez hodowlę w GM-CSF i IL-4 (dane nie przedstawione). Jednakże ekspresja DNGR-1 była widoczna w dyskretnej subpopulacji DC krwi, zdefiniowanej jako linia ujemna w linii komórek HLA-DR + (Figura 9A) z charakterystyczną morfologią dendrytyczną (Figura 10). Zgłoszono pięć różnych podzbiorów DC krwi, w tym populację CD123 + pDC i różne podzbiory przypuszczalnie mieloidalnej CD123. DC można odróżnić na podstawie ekspresji CD16, CD1b / c, BDCA-3 i CD34 (50). Podpopulacja DC dla DNGR-1 + była ujemna dla CD123, co sugeruje, że ludzkie pDC nie eksprymują DNGR-1, w przeciwieństwie do pDCs u myszy (Figura 9B). DNGR-1 + DC krwi również były negatywne dla CD34, CD16 i CD1b / c. Jednakże DNGR-1 + DC były jednakowo dodatnie dla BDCA-3 (Figura 9B). Zatem ludzki DNGR-1 selektywnie zaznacza odrębną populację poprzednio opisaną jako BDCA-3 + DC. Figura 9 Ludzka ekspresja DNGR-1 jest ograniczona do DC krwi BDCA-3 +. (A) Ludzkie PBMC wybarwiono anty-hDNGR-1 (8F9) lub dopasowanym izotypowo przeciwciałem kontrolnym (mysie IgG2a) i wybarwiono kontrastowo dla różnych markerów leukocytów. Histogramy pokazują barwienie DNGR-1 na komórkach T, komórkach B, monocytach, komórkach NK, HLA-DR nie-lineage-ujemnym. komórki i ujemne w linii komórki HLA-DR +. Liczby wskazują procent komórek hDNGR-1 + w drugiej frakcji. (B) PBMC przedstawione w A były bramkowane na komórkach HLA-DR + pozbawionych linii. Plamki punktowe wykazują wybarwianie anty-DNGR-1 lub dopasowanymi izotypowo mAb kontrolnymi wobec różnych markerów podzbioru krwi DC. Liczby reprezentują procent komórek w każdym kwadrancie. Rycina 10 Eukocytoza mAb anty-ludzkich DNGR-1 przez DC krwi BDCA-3 +. Ludzka krew BDCA-3 + DC barwiono anty-hDNGR-1 (8F9) lub dopasowanym izotypowo przeciwciałem kontrolnym (mysie IgG2a), płukano i pozostawiano w 4 ° C (górne panele) lub 37 ° C (dolne panele) na 2 godziny przed utrwaleniem i montażem. Pokazano reprezentatywne przekroje optyczne (<0,7 .m). Oryginalne powiększenie, × 1260. Na koniec oceniliśmy, czy ludzki DNGR-1, podobnie jak jego mysi ortolog, może funkcjonować jako receptor endocytowy w DC [więcej w: cytologia płynna, dieta wrzodowa jadłospis, szpik w kości krzyżówka ]