Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad 5

Kowalentnie sprzężono anty-DNGR-1 lub dopasowane do izotypu kontrolne mAb do biotynylowanej pochodnej SIINFEKL, immunodominującego peptydu w odpowiedzi CTL ograniczonej H-2 Kb do białka OVA (SIINFEKLC-eahks-biotyna [S1]; patrz Metody ). Wszystkie koniugaty S1-mAb zawierały od do 1,2 cząsteczek biotyny (tj. 1. 1,2 peptydy) na przeciwciało i mogły być prezentowane na żywo, ale nie przez ustalone DC in vitro, co wskazuje, że nie są one podatne na proteolizę zewnątrzkomórkową i muszą być przetwarzane przez komórki w celu uwolnienia peptydu antygenowego (dane nie pokazane). Myszom wstrzyknięto dożylnie 2 .g koniugatu, a splenocyty odzyskano 16 godzin później, rozdzielono na podstawie ekspresji CD11c i testowano pod kątem zdolności do stymulacji komórek T OT-I jako odczyt dla prezentacji peptydu OVA (Figura 5A ). Tylko splenocyty CD11c + z myszy, które otrzymały anty-DNGR-1A1, były zdolne do indukowania proliferacji OT-1 i IFN-y. wytwarzanie (Figura 5A), chociaż wszystkie frakcje komórkowe stymulowały pulsowanie ex vivo peptydem SIINFEKL (dane nie pokazane). Aby zidentyfikować zaangażowane APC, komórki CD11c + od myszy traktowanych anty-DNGR-1 (3S1 posortowano do 3 głównych podzbiorów cDC. Tylko podzbiór CD8a + cDC był zdolny do stymulacji komórek OT-1 (Figura 5B), chociaż wszystkie podzbiory były równie kompetentne, aby to zrobić w obecności dodanego peptydu (nie pokazano, patrz odnośnik 9). Warto zauważyć, że pDC oczyszczone od myszy leczonych anty-DNGR-lp nie stymulowały komórek OT-1 (dane nie pokazane). Jednak te same komórki stymulowały tylko słabo w obecności dodanego peptydu SIINFEKL (~ 60-krotnie niższa odpowiedź niż dla podgrup cDC), co sugeruje, że są one słabymi APC w tych warunkach. Wnioskujemy, że mAb anty-DNGR-1 można stosować do selektywnego dostarczania egzogennego antygenu do prezentacji krzyżowej przez CD8a + DC in vivo. Figura 5 Antygen ukierunkowany na DNGR-1 in vivo jest krzyżowo prezentowany przez CD8y + DC. (A) 2 .g skoniugowanego z S1 przeciwciała anty-DNGR-1 (7H11) lub szczurzego przeciwciała IgG1 o dopasowanym izotypie wstrzyknięto iv Następnego dnia CD11c + i CD11c. Frakcje komórek śledziony przygotowano i stopniowane liczby hodowano przez 4 dni za pomocą komórek OT-I znakowanych CFSE. Histogramy pokazują profile CFSE komórek OT-I inkubowanych z 25 x 103 CD11c. lub splenocyty CDllc +. Prawe panele pokazują absolutną liczbę komórek OT-1 na studzienkę i IFN-y zawartość w supernatantach. (B) Wskazane podzestawy DC oczyszczone od myszy, którym wstrzyknięto 2 .g S1 (3 anty-DNGR-1 (7H11) hodowano przez 3 dni za pomocą komórek OT-I znakowanych CFSE. Odpowiedź analizowano jak w A. Dane są reprezentatywne dla co najmniej 3 eksperymentów. Kierowanie antygenu do DNGR-1 wraz z adiuwantem indukuje priming CTL. Zbadaliśmy, czy celowanie in vivo anty-DNGR-1 skoniugowanym z peptydem S1 może wywoływać swoiste namnażanie CTL w obecności lub nieobecności anty-CD40, często stosowanych jako adiuwant w eksperymentach z ukierunkowaniem na przeciwciała (23, 24). Myszom wstrzyknięto 2 .g anty-DNGR-1 Sl lub dopasowaną pod względem izotypu kontrolę S1. anty-CD40 (25 ug) (Figura 6). Aby przetestować indukcję aktywności CTL in vivo, 5 dni później wlewano splenocyty z kongenicznych myszy CD45.1 B6.SJL obciążonych różnymi dawkami peptydu CFSE i SIINFEKL i monitorowano specyficzną eliminację komórek pulsowych peptydów. Myszy, którym podawano S1 sprzężone z kontrolnymi mAb, nie eliminowały komórek docelowych niezależnie od jednoczesnego podawania anty-CD40 (Figura 6A). Przeciwnie, komórki docelowe zostały całkowicie wyeliminowane z myszy, którym S1 sprzężono z anty-DNGR-1 razem z anty-CD40 (Figura 6A). Nie obserwowano odpowiedzi, gdy mAb anty-CD40 zostało pominięte (Figura 6A). Odwrotnie, inne adiuwanty, takie jak poli I: C, mogą zastąpić anty-CD40 w promowaniu krzyżowego zasiedlania anty-DNGR-1 (3 (dane nie przedstawione). Zgodnie z eliminacją komórek docelowych, znaczną liczbę komórek T CD8 + pozytywnych względem tetrameru OVA / H-2 Kbp znaleziono tylko w śledzionach i krwi myszy, które otrzymały anty-DNGR-1 (3-S1 razem z anty-CD40 (fig. 6B). Ponowna stymulacja tych samych komórek peptydem SIINFEKL in vitro spowodowała wtórną ekspansję, z IFN-a produkcja i określone zabijanie (rysunek 6C). Identyczne wyniki uzyskano stosując anty-DNGR-1 skoniugowany z dłuższym peptydem OVA zawierającym epitop SIINFEKL (S2, SIINFEKLTEWTSSNVMEERC-eahx-biotyna, dane nie przedstawione) lub białkiem OVA o pełnej długości (Figura 6D). Warto zauważyć, że wolny peptyd S1 nie był w stanie indukować odpowiedzi in vivo na zabijanie lub wywoływać znaczącej liczby komórek pozytywnych względem tetrameru, nawet gdy podawano go 100 razy w stosunku do ilości obecnej w koniugatach anty-DNGR-1 (3S1 (Suplementowa Figura 8). Wnioskujemy, że ukierunkowanie egzogennego antygenu na DNGR-1 wraz z odpowiednim adiuwantem umożliwia wydajne krzyżowe primowanie komórek T CD8 +. Figura 6CT-priming z ukierunkowaniem antygenu na DNGR-1 plus anty-CD40
[patrz też: dom na przeklętym wzgórzu cda, hipertriglicerydemia, dlaczego psy nie mogą jeść czekolady ]