Terapia nowotworowa u myszy poprzez celowanie antygenem w nowatorską lektynę typu C ograniczoną do DC ad 10

C57BL / 6, B6.SJL i OT-I × rag. /. (Tło C57BL / 6) hodowano w Cancer Research UK w warunkach specyficznych dla wolnych od patogenu. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną ds. Etyki w Instytucie Zwierząt, Cancer Research UK. Komórki. Pożywką hodowlaną była RPMI 1640 (Invitrogen) uzupełniona glutaminą, penicyliną, streptomycyną, 2-merkaptoetanolem (wszystkie z Invitrogen) i 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (Bioclear). BMDC myszy wytworzono stosując GM-CSF i oczyszczono z kultur objętościowych przez selekcję magnetyczną za pomocą mikrokulek anty-CD11c (BMC GM-CSF). Alternatywnie, BMDC wytworzono przez hodowlę komórek BM w obecności 100 ng / ml Flt3L (R & D) przez 10 dni, po którym to czasie wszystkie żywe komórki były pozytywne pod względem CD11c (BMDC Flt3L). Komórki śledziony przygotowano przez trawienie liberazą / DNAzą i wzbogacono dla DC przez selekcję pozytywną za pomocą mikrokulek anty-CD11c. Komórki T OT-1 (z węzłów chłonnych i śledziony) oczyszczono przez selekcję negatywną, stosując koktajl biotynylowanych przeciwciał (anty-CDllc, CDllb, B220, FcyR, Gr-1 i CD4), a następnie mikroperełki streptawidynowe. Ludzkie PBMC przygotowano z powleczonych leukocytem kożuszków leukocytarnych (National Blood Transfusion Service, Wielka Brytania) przez sedymentację w stosunku do Ficoll-Hypaque (GE-Healthcare). Komórki B3Z były prezentem N. Shastriego (University of California, Berkeley, Berkeley, Kalifornia, USA), a linia komórkowa KG-1 została dostarczona przez P. Cresswella (Yale University, New Haven, Connecticut, USA). RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano stosując Trizol (Invitrogen) z mysich podzbiorów DC oczyszczonych przez sortowanie komórek lub z ludzkiej linii komórkowej KG-1. cDNA przygotowano przez trawienie DNAse (wolne od DNA, Ambion) i odwrotną transkrypcję z odwrotną transkryptazą Superscript II (Invitrogen), 1. M trifosforanem deoksyrybonukleotydu (dNTP) i 10. M losowymi heksanukleotydami (Invitrogen). cDNA amplifikowano stosując 35 cykli PCR składających się z 30 sekund w 94 ° C, 30 sekund w 55 ° C i minuta w 72 ° C. Sekwencje starterów były następujące: mDNGR-1, do przodu: 5 (3 -AGACTGCTTCACCACTCCAA-3; mDNGR-1, wsteczny: 5a-CTTGGCACAATGGACAAGGT-3; P-aktyna, do przodu: 5a-GTTTGAGACCTTCAACACCCC-3; P-aktyna, rewers: 5a-GTGGCCATCTCCTGCTCGAAGTC-3 .; hDNGR-1, do przodu: 5a-CCCAAGTCTCATTTGGAGGA-3; hDNGR-1, rewers: 5a-AAATCTGGACGGTGTGGAAG-3 .. Generowanie mAb anty-DNGR-1. Szczury Wistar lub myszy BALB / c immunizowano 3. 4 razy komórkami RBL-2H3 wyrażającymi odpowiednio mysie lub ludzkie DNGR-1 poddane fuzji z epitopem HA. Połączenie splenocytów z linią komórkową szpiczaka szczura Y3 lub linią szpiczaka myszy SP2 / 0 przeprowadzono standardowymi procedurami. Do przeszukiwania hybrydom stosowano linię komórkową B3Z, która eksprymuje reporter a-galu dla czynnika jądrowego aktywowanych komórek T (NFAT) (60). Tę linię komórkową transdukowano retrowirusem kodującym chimerę zewnątrzkomórkowej domeny mysiego lub ludzkiego DNGR-1 połączonego z regionem transbłonowym z NKRP1B i wewnątrzkomórkowego ogonka CD3a. a następnie sekwencja wewnętrznego miejsca wejścia dla rybosomu (IRES) i gen GFP (61). Supernatanty hybrydoma badano pod kątem zdolności do wiązania się z chimerą DNGR-1, co skutkowało aktywacją reportera NFAT i indukcją aktywności p-galu (61). Supernatanty, które w tym teście dały wynik dodatni, zostały następnie przebadane za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu mieszaniny komórek B3Z eksprymujących chimerę DNGR-1 (GFP +) i macierzyste komórki B3Z (GFPa) (patrz Suplementowa Figura 5). Ta metoda umożliwiła selekcję 3 szczurzych mAb specyficznych dla mDNGR-1 (1F6 [szczur IgG1], 397 [szczur IgG2a] i 7H11 [szczurzy IgG1]) i mysie mAb specyficzne dla hDNGR-1 (8F9 [IgG2a]). 7H11 anty-mDNGR-1 wybrano do większości opisanych tu badań i skoniugowano z biotyną lub z Alexa Fluor 488 (Invitrogen) do barwienia lub peptydami OVA do celowania, jak opisano poniżej. Cytometrii przepływowej. Fluorochromowe lub znakowane biotyną przeciwciała swoiste dla mysich CD11c, CD24, CD11b, B220, Ly6C, CD4 i CD8. byli z BD Biosciences. Pharmingen. Oczyszczone 2,4G2 (anty-FcyRIII / II) pochodziło z usługi produkcji przeciwciał Cancer Research UK. Zawiesiny komórek myszy inkubowano z 10 .g / ml mAb 2,4 G2 w celu zablokowania Fc. receptorów, a następnie barwiono je w lodowatym PBS uzupełnionym 2 mM EDTA, 1% FCS i 0,02% azydkiem sodu. W badaniach endocytozy komórki blokowane FcyR wyznakowano 5 ug / ml biotynylowanego mAb anty-DNGR-1 przez 30 minut w temperaturze 4 ° C. Komórki następnie przemyto dwukrotnie i inkubowano przez różne czasy w 4 ° C lub 37 ° C przed przeniesieniem na lód i dodaniem streptawidyny PE
[podobne: hipertriglicerydemia, allegro pok, dehydratacja krążków międzykręgowych leczenie ]