Terapeutyczna supresja inicjacji translacji moduluje chemosensitivity w mysim modelu chłoniaka cd

Sieciowanie gatunków o wyższej masie cząsteczkowej (> 175 kDa) jest wskazane przez AEIF4G ponieważ może odzwierciedlać związany z RNA eIF4G. Właściwa rekrutacja kompleksu preinicjacyjnego 43S do mRNA 5. końce są zależne od eIF4F, którego aktywność można badać za pomocą chemicznego testu sieciowania (30). W tym przypadku czynniki inicjacji (IF) zostały usieciowane do struktury czapeczki znakowanego radioaktywnie mRNA i rozdzielone przez SDS-PAGE (Figura 2B). Sieciowanie eIF4E do struktury czapeczki jest niezależne od ATP, podczas gdy sieciowanie eIF4A i eIF4B jest zależne od ATP (figura 2B, porównaj linię 2 z ścieżką 1), jak wcześniej podano (30). Wiązanie eIF4A, eIF4B i eIF4E do mRNA jest specyficzne dla kapu, ponieważ m7GDP, ale nie GDP, powoduje zmniejszenie ich sieciowania (Figura 2B, porównaj ścieżki 3 i 4 z pasmem 1). FA stymulował sieciowanie eIF4A, ale nie eIF4B i eIF4E, do mRNA (Figura 2B, porównaj ścieżkę 6 z linią 5). Zwiększone sieciowanie eIF4A powodowane przez silvestrol jest specyficzne dla kapu i zależne od ATP (dane nie pokazane). eIF4A istnieje w postaci wolnej (eIF4Af) lub jako część kompleksu eIF4F (eIF4Ac) i jest uważany za zawracany przez eIF4F podczas inicjacji tłumaczenia (31, 32). Aby ocenić wpływ CBF na aktywność wiązania eIF4Af i eIF4Ac wiążącą RNA, przeprowadzono eksperymenty sieciowania przy użyciu rekombinowanego eIF4AIf (Figura 2C) lub oczyszczonego eIF4F (Figura 2D). FA i silvestrol stymulowały sieciowanie eIF4AIf (Figura 2C, ścieżki 1-3) i eIF4Ac (Figura 2D, porównanie ścieżki 2 z ścieżką 1) z mRNA. Zgodnie ze zdolnością CBF do zakłócania aktywności eIF4Af, FA hamował translację kierowaną przez zależny od eIF4A wirus zapalenia mięśnia sercowego i mózgu (EMCV) IRES (Suplementowa Figura 2) (2). Jednym z możliwych mechanizmów, za pomocą których CBF mogą hamować translację, może być indukowanie sekwestracji eIF4Af na RNA, tak że mniej eIF4A jest dostępne do złożenia w kompleks eIF4F. eIF4A jest członkiem rodziny białek DEAD-box, zawierającej więcej niż 35 członków posiadających 9 zachowanych motywów aminokwasowych (33). Zbadaliśmy selektywność CBF poprzez testowanie wpływu FA na aktywność innych białek DEAD-box. FA nie stymulowało sieciowania Ded1 do mRNA (dodatkowa Figura 3A, porównaj ścieżkę 4 z ścieżką 3). Zbadaliśmy także wpływ FA na splatanie mRNA, proces, o którym wiadomo, że wymaga aktywności więcej niż 7 białek DEXD / H-box (34) i odkrył, że FA nie wpływa na splicing in vitro (Uzupełniająca figura 3B, porównaj ścieżkę 4). z pasmem 3). Te wyniki, oprócz ustaleń, że CBF nie wpływają na aktywność wiążącą RNA eIF4B i eIF4E (Figura 2B) lub YB-1 (dane nie przedstawione), wskazują, że te związki wykazują selektywność w kierunku eIF4A. CBF hamują translację in vivo i wyzwalają apoptozę. W celu określenia siły działania CBF na syntezę białek in vivo, przeprowadziliśmy badania metabolizmu (rysunek 3A). FA i silvestrol skutecznie hamowały inkorporację [35S] metioniny do białek w sposób zależny od dawki, przy czym silvestrol był silniejszy niż FA in vivo (Figura 3A, IC50 dla FA, ~ 0,1