Terapeutyczna supresja inicjacji translacji moduluje chemosensitivity w mysim modelu chłoniaka ad 9

Dla testów lucyferazy in vivo, 293 komórek utrzymywano w pożywce DMEM uzupełnionej 10% FCS. Dzień przed transfekcją fosforanem wapnia komórki wysiano na 3 x 106 komórek / 10 cm naczynie. Po transfekcji pcDNA / Ren / HCV / FF, 293 komórek inkubowano przez 10 godzin z podłożem (MeOH) lub CBF przed zbiorem i zebrano 48 godzin po transfekcji. Testy lucyferazy przeprowadzono z zestawem do testu podwójnej lucyferazy zgodnie z instrukcjami producenta (Promega). Sondy do analizy Northern zostały wykonane przy użyciu zestawu Rediprime (Amersham). W przypadku testów wiązania aneksyny V komórki Jurkat utrzymywano w pożywce RPMI uzupełnionej 10% FCS. Komórki (1 x 106) wysiewano na 12-studzienkowe płytki i inkubowano z podłożem (MeOH) lub silvestrolem przez 13 godzin. Komórki zebrano przez odwirowanie, przemyto PBS i ponownie zawieszono w 500 .l buforu wiążącego aneksynę V (10 mM HEPES, pH 7,4, 140 mM NaCl, 5 mM CaCI2). Dodawano pięć mikrolitrów aneksyny VFITC (BD Biosciences. Pharmingen) i reakcje inkubowano przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie dodano jodek propidyny (PI) (1 .g / L) i reakcje inkubowano przez kolejne 5 minut. Procent żywych komórek (ujemny dla wybarwienia aneksyny V i PI) mierzono za pomocą cytometrii przepływowej i wyrażano w stosunku do komórek traktowanych MeOH. Badania metabolizmu in vivo. W skrócie, 6 x 104 komórek HeLa wysiano na 24-studzienkowe płytki dzień przed eksperymentem. Komórki inkubowano w obecności związku lub zaróbki we wskazanych okresach czasu. [35S] metioninę (150. 225. Ci / ml) i [3H] urydynę (24. Ci / ml) dodano do komórek 10 minut przed zbiorem, podczas gdy [3H] tymidynę (48. Ci / ml) dodano do komórek 20 minut przed zbiorami. Do znakowania białkowego dodano [35S] metioninę w pożywce bez metioniny uzupełnionej 10% dializowanym FCS. W celu znakowania [3H] urydyny i [3H] tymidyny, izotopy dodano w DMEM uzupełnionym 10% dializowanym FCS. Komórki następnie zebrano i poddano lizie w buforze RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% dezoksycholanie sodu, 0,1% SDS). Wyznakowane radioaktywnie białka wyizolowano metodą strącania TCA na papierze Whatman 3 MM. Wyznakowane radioaktywnie kwasy nukleinowe wyizolowano przez filtrację przez filtry z włókna szklanego Whatman GF / C. Ilość radioaktywności oznaczono przez zliczanie scyntylacyjne, a zliczenia znormalizowano do stężenia białka, które określono przy użyciu zmodyfikowanego testu Lowry ego (DC Protein Assay, Bio-Rad). Wiązanie rybosomu i chemiczne sieciowanie. Testy wiązania rybosomu przeprowadzono przez inkubację mRNA CAT znakowanego [32P] w lizacie króliczej retikulocytów w obecności 600. M cykloheksimidu (CHX), nośnika (MeOH) lub 100. M FA w 30 ° C przez 10 minut (23). . Po odwirowaniu przez 10% -30% gradientów glicerolu (SW40; 187 000 g / 3,5 godziny), frakcje z każdego gradientu zebrano za pomocą Brandel Tube Piercer podłączonego do kolektora frakcji ISCO. Zebrano frakcje po 500 ul, a radioaktywność oznaczono przez zliczanie scyntylacyjne. Chemiczne sieciowanie preparatów czynnika inicjującego do znakowanego [32P] znakowanego oksydowo mRNA CAT przeprowadzono w standardowych warunkach reakcji (30) zawierających 0,9 mM ATP. Do chemicznego sieciowania z poszczególnymi czynnikami stosowano .g rekombinowanego eIF4AIf, .g Ded1 lub 0,7 .g eIF4F. Po sieciowaniu, próbki potraktowano RNazą A i rozdzielono na 10%. 15% żelach gradientowych SDS-PAGE (dla preparatów do płukania rybosomalnych soli) lub 10% żelach SDS-PAGE (dla eIF4Af lub eIF4F). Żele suszono i eksponowano na folię X-Omat (Kodak) w temperaturze około 70 ° C z sitem intensyfikującym. Profilowanie polisomów i Western blotting. Profile polisomów generowano zgodnie z wcześniejszym opisem (42). W skrócie, 2 x 107 komórek Jurkat inkubowano z nośnikiem (MeOH) lub 0,2. M silvestrolem przez godzinę. W celu profilowania polisomów przeprowadzonego za pomocą guzów Pten + / AE-Myc, chłoniaki ekstrahowano ze zwierząt po 4-godzinnym traktowaniu nośnikiem (MeOH) lub 1,0 mg / kg silvestrolu. W obu przypadkach komórki zebrano i poddano lizie w buforze A (5 mM Tris, pH 7,5, 2,5 mM MgCl2, 1,5 mM KCl, 2 mM DTT, 1% Triton X-100, 0,5% dezoksycholanie sodu) w obecności 100 yg / ml cykloheksimidu. Tam, gdzie to wskazano, supernatanty traktowano nukleazą mikrokokową przez inkubację w temperaturze pokojowej z mM CaCl2 i 100 U / ml nukleazy mikrokokowej przez 20 minut, a następnie reakcję przerwano przez dodanie 2 mM EGTA. Lizaty naniesiono na gradienty 10% -50% sacharozy i odwirowano w rotorze SW40 przy 150 000 g przez 2 godziny.
[więcej w: dolargan ulotka, allegro pok, dieta wrzodowa jadłospis ]