Przenoszenie wirusa zapalenia wątroby typu C przez pacjenta podczas kolonoskopii cd

Znakowany produkt otrzymany z regionu 5 nieulegającego translacji hybrydyzuje z sondą, która doskonale pasuje do sekwencji. Po hybrydyzacji dodaje się streptawidynę znakowaną alkaliczną fosfatazą i wiąże się z wytworzoną biotynylowaną hybrydą. Technika ta umożliwia wykrycie sześciu głównych typów HCV i ich najczęstszych podtypów. Aby zbadać sekwencje HCV u trzech pacjentów, przeprowadziliśmy zagnieżdżoną PCR z odwrotną transkrypcją w niestrukturalnym regionie 3 (NS3) z próbkami surowicy pacjentów (stosując startery opisane w Tabeli 1). Region NS3 prawdopodobnie koduje proteazę i helikazę. Surowicę pozytywną dla genotypu 1b HCV zastosowano jako kontrolę pozytywną, a jako kontrolę negatywną zastosowano ujemną surowicę dla RNA HCV. Region NS3 został wybrany do analizy sekwencjonowania, ponieważ regiony niekodujące i rdzeniowe 5 wydają się być dość konserwatywne wśród różnych typów HCV, podczas gdy domniemane regiony otoczki są wysoce zmienne nawet wśród przykładów tego samego podtypu HCV.11
Aby sprawdzić wielkość produktów amplifikacji, produkty PCR poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym i wizualizowano za pomocą barwienia bromkiem etydyny (spodziewany rozmiar, 186 bp). Każdą próbkę badano w trzech powtórzeniach. Produkty PCR delikatnie oddzielono od żelu agarozowego, oczyszczono przez rozdzielenie minikolumną (Wizard A7170, Promega, Madison, Wis.) I eluowano w 50 .l wody destylowanej. Całkowitą wydajność DNA określono metodą spektrofotometrii; 100 ng oczyszczonego produktu DNA zastosowano w reakcjach sekwencjonowania cyklicznego (Prism 401388, Applied Biosystems, Foster City, CA), które przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Produkty sekwencjonowania analizowano za pomocą systemu sekwencjonowania DNA (Model 373 A, Applied Biosystems). Co najmniej dwie reakcje sekwencjonowania przeprowadzono dla każdej próbki, z odpowiednimi starterami sensownymi i antysensowymi (Tabela 1). Sekwencje dopasowano do użycia programu Clustal V, który jest szeroko stosowany do badania dopasowania wielu sekwencji. 12 To oprogramowanie jest oferowane pod różnymi nazwami przez różnych producentów. Użyliśmy Assemblylign (Kodak International Biotechnologies, New Haven, Conn.). Porównania nukleotydów porównano u trzech pacjentów, surowicy kontrolnej dodatniej pod względem genotypu 1b HCV i opublikowanej sekwencji genotypu 1b.8,13 HCV.
Wyniki
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe RNA wirusa HCV
Próbki surowicy zebrane od Pacjentów i 2 w styczniu 1995 r. Wykazały ujemny wynik testu na HCV RNA, natomiast próbki uzyskane w październiku i listopadzie 1995 r. Były pozytywne. Poziom wiremii pacjenta 3 w listopadzie 1995 r. Wynosił 3,5 miliona ekwiwalentów genomu na mililitr.
Genotypowanie i sekwencjonowanie HCV
Figura 2. Figura 2. Sekwencja nukleotydowa regionu genu NS3 HCV u trzech pacjentów, którzy przebadali kolonoskopię 16 marca 1995 r., W porównaniu z sekwencją pozytywną dla surowicy kontrolnej dla genotypu 1b HCV i dwie opublikowane sekwencje tego genotypu. Stwierdzono 100 procent homologii wśród trzech pacjentów w odniesieniu do zsekwencjonowanych nukleotydów. Przecinki w kontrolnych i opublikowanych sekwencjach oznaczają nukleotydy identyczne z tymi zsekwencjonowanymi u pacjentów; pokazano tylko rozbieżne nukleotydy
[więcej w: dekstran, teosyal, agaricus ]
[przypisy: endoproteza stawu biodrowego rodzaje, erytrocyty w cytologii, erytrol opinie ]