Przenoszenie wirusa zapalenia wątroby typu C przez pacjenta podczas kolonoskopii ad

Tylko 3 kolonoskopie wykonano 16 marca 1995 roku. Pierwsza z nich obejmowała 42-letnią kobietę (Pacjenta 3) z historią polipektomii. Wiedziała, że przez rok była pozytywna na HCV, ale nie była leczona, ponieważ miała przewlekłą depresję. W listopadzie 1995 r. Jej poziom aminotransferazy alaninowej w surowicy wynosił 43 IU na litr (normalny poziom, <40). Testy serologiczne były pozytywne dla HCV i negatywne dla HBV i HIV. Wykrywanie i miareczkowanie HCV RNA
Tabela 1. Tabela 1. Sekwencje nukleotydowe i pozycje starterów HCV. Próbki surowicy pobrane od pacjentów i 2 zebrane w styczniu 1995 r. W momencie oddawania krwi i zamrożone w temperaturze -80 ° C, a próbki surowicy pobrane od pacjentów 1, 2 i 3 w październiku i listopadzie 1995 r. Zostały przebadane na obecność HCV RNA w odwrotnej kolejności. transkrypcyjna reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) ze starterami z wysoce konserwatywnego 5 niekodującego regionu genomu HCV (Tabela 1). W skrócie, RNA wyekstrahowano ze 100 .l surowicy za pomocą metody opisanej przez Chomczynski i Sacchi.9 Próbki RNA ogrzewano przez 10 minut w temperaturze 70 ° C, a następnie inkubowano przez 60 minut w 37 ° C w mieszaninie reakcyjnej zawierającej odwrócone próbki. bufor transkrypcyjny, 10 mM ditiotreitol, mM każdego trójfosforanu deoksynukleotydu, 10 U RNAsiny (Life Technologies, Cergy Pontoise, Francja), 200 U odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloney (Life Technologies) i 0,4 mM zewnętrzny antysensowny starter. Próbki następnie ogrzewano do 100 ° C przez 10 minut. Jako kontrolę negatywną zastosowano wodę destylowaną, bufor do ekstrakcji i próbki surowicy ujemne względem HCV. Surowica dodatnia pod względem RNA HCV służyła jako kontrola pozytywna. Komplementarny DNA (cDNA) amplifikowano za pomocą zagnieżdżonego PCR10. Pierwszą reakcję PCR przeprowadzono w 50 .l mieszaniny reakcyjnej zawierającej bufor polimerazy Taq, mM każdego trifosforanu deoksynukleotydu, 1,5 mM chlorku magnezu, mM każdego zewnętrznego startera, U polimerazy Taq (Life Technologies) i 5 .l cDNA. Przeprowadzono 35 cykli PCR składających się z denaturacji w 95 ° C przez jedną minutę, hybrydyzacji w 55 ° C przez jedną minutę i wydłużania w 72 ° C przez jedną minutę.
Drugą reakcję PCR przeprowadzono jak opisano powyżej dla 25 cykli, z 5 .l pierwszego produktu PCR i wewnętrznych starterów. Produkty PCR poddano elektroforezie w 2% żelu agarozowym, wybarwiono bromkiem etydyny i wizualizowano w świetle ultrafioletowym. Oczekiwana wielkość produktu amplifikacji wynosiła 190 pz.
RNA HCV zmierzono w surowicy za pomocą testu DNA o rozgałęzionym łańcuchu (Quantiplex bDNA 2,00, Chiron Diagnostics Europe, Cergy Pontoise, Francja) zgodnie z instrukcjami producenta.
Genotypowanie HCV i sekwencjonowanie nukleotydów
Genotypowanie HCV przeprowadzono za pomocą testu sondą liniową zgodnie z instrukcjami producenta (Innogenetics, Antwerpia, Belgia). Ten test oparty jest na odmianach w nieulegających translacji regionach 5 różnych genotypów HCV. W teście sondy liniowej sondy swoiste dla typu znakuje się ogonami poli (T) za pomocą końcowej dezoksynukleotydylowej transferazy i przyłącza się do błon nitrocelulozowych. Produkty amplifikowane znakowane biotyną są hybrydyzowane w kierunku odwrotnym do sond na pasku nitrocelulozowym. Grupę biotyną włącza się przy użyciu 5 -biotynylowanego startera podczas amplifikacji
[patrz też: anakinra, Corsodyl, diltiazem ]
[więcej w: dysplazja włóknista kości, dystymia leczenie, embolizacja naczyniaka ]